龍血竭提取物促進創面愈合的實驗研究

劉輝輝 肖丹 鄭曉 顧巖 郭善禹

創面愈合是外科領域中的重要問題，糖尿病、截癱、局部放射線損傷等所致的創面難以愈合[1-2]。促進創面愈合的治療方法包括清創、應用抗生素、組織移植和應用生長因子等。中草藥因療效確切、適應證廣泛、價廉、使用方便等特點，至今仍被廣泛使用。許多中草藥已被證明具有促進創面愈合的功能[3-4]。龍血竭（Resina Draconis）為劍葉龍血樹樹干產生的紅色樹脂，多用于活血化瘀、消炎止痛等。現代藥理學研究表明，龍血竭具有良好的活血化瘀、抗栓、抗氧化、抗菌消炎等生理活性[5-6]。近年來，臨床應用龍血竭治療難愈性創面，具有良好的療效。本實驗運用乙醇提取法制備龍血竭提取物，并作用于大鼠創面，為探討龍血竭促進創面愈合的生物學機制，提供可靠的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要儀器與試劑

SD大鼠48只，體質量170～200 g，雄性，由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物中心提供；龍血竭由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院藥劑科提供；CD31單克隆抗體（Epitomics公司）；VEGF 單克隆抗體 （Epitomics公司）；Trizol（Invitrogen公司）；SYBR Green熒光定量試劑盒（Takara 公 司）；Stratagene Mx3000P （Stratagene 公司）；Image Pro Plus軟件（Media Cybernnetics公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物提取與植物成分化學分析

龍血竭100 g，用95%乙醇浸泡 48 h，過濾，收集乙醇液，過濾并蒸餾回收乙醇，得干燥紅色結晶，即為龍血竭提取物。龍血竭提取物軟膏由5 g提取物與100 g凡士林混勻而成。

植物化學成分定性分析參考Harborne和Kokate等方法[7]，檢測發現乙醇提取物中有黃酮類、強心苷類、三萜類、酚類、生物堿類和皂甙類化合物。

1.2.2 動物模型與實驗分組

將健康成年48只SD大鼠隨機分為對照組、濕潤燒傷膏組 （MEBO組）、龍血竭乙醇提取物組（RDEE組）3組，每組16只。將各組大鼠腹腔注射麻醉，剃去背部毛發后于大鼠背部中上作一直徑為1.8 cm的圓形全層皮膚創面，將凡士林、MEBO和RDEE軟膏涂于無菌紗布上，面積與創面相當，覆蓋于創面并包扎。術后單籠飼養，隔日換藥，自由飲食。

1.3 結果檢測

1.3.1 創面愈合率與愈合時間

于大鼠傷后3 d、7 d、11 d和15 d，肉眼觀察，記錄創面愈合情況。數碼相機拍照，Image Pro Plus軟件分析，計算創面愈合率。觀察創面愈合情況，以完全上皮覆蓋作為創面愈合標準[8]。

1.3.2 組織病理學檢測

于術后 3 d、7 d、11 d、15 d 各組取 3 只大鼠的創面組織。將創面組織用4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋切片 （厚度 4 μm），HE、Masson染色，光鏡下觀察組織炎癥反應、成纖維細胞、新生血管和肉芽組織等[9]。

1.3.3 CD31免疫組化染色與創面微血管密度（MVD）計算

石蠟切片于70℃恒溫箱中烘烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。室溫下滴加0.3%過氧化氫甲醛溶液，10 min后PBS洗滌3次。0.1%胰蛋白酶37℃，30 min，PBS洗滌 3次。 DAB 室溫 30 min，甩干。滴加一抗CD31，1∶500稀釋，4℃過夜。PBS洗滌3 次。滴加二抗（anti-Rabbit）37 ℃，30 min。PBS 洗滌3次，顯色5 min，并用PBS充分沖洗。蘇木素復染1 min，自來水充分沖洗 30 min。梯度乙醇脫水、二甲苯透明。中性樹脂封片并加蓋玻片，自然晾干。

創面微血管密度（MVD）計算，每張切片光鏡下觀察，胞質呈棕黃色者為CD31表達陽性細胞，以CD31表達陽性細胞或細胞簇作為1個血管計數單位，在低倍鏡（40×）下選擇微血管密度最高的3個區域，于高倍鏡（200×）下計數3個視野的MVD，取其平均數為該標本的MVD[10]。

1.3.4 創面肉芽組織VEGF mRNA表達檢測

使用Trizol試劑盒抽提組織總RNA，并反轉錄成cDNA。采用SYBR Green熒光定量試劑盒進行聚合酶鏈反應。引物序列，VEGF forward：5'-CACCA AAGCAGCACATAGGAGA-3'，reverse：5'-TTACAC GTCTGCGGATCTTGGACA-3'；GAPDH forward：5'-GAACGGGAAGCTCACTGGC-3'，reverse：5'-GCATG TCAGATCCACAACGG-3'。擴增條件為 95 ℃，30 sec；60℃，30 sec， 共 40循環，72℃，5 min。 以 GAPDH為內參，Stratagene Mx3000P進行SYBR Green熒光定量PCR分析，每個樣品重復3管。

1.3.5 Western Blot分析VEGF的表達

組織勻漿后用RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定濃度。10%SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜，37℃封閉2 h，加一抗，4℃孵育過夜（VEGF，1∶200），以辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min，ECL發光X線片顯影，GAPDH作為內參。用ImagePro Plus 6.0軟件分析結果。

1.4 統計學處理

采用SPSS16.0軟件分析，所有數據以均值±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組均數間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 創面愈合率和愈合時間

術后第 3、7、11、15 天 MEBO 和 RDEE 組創面愈合率均高于對照組 （P<0.05），MEBO組和RDEE組之間差異無統計學意義（圖1）。對照組、MEBO組和RDEE組的創面平均愈合時間分別為 （18.67±0.82） d、（14.16±0.75） d 和（15.12±0.75） d，MEBO 組和RDEE組愈合時間與對照組相比約提前3.5 d，有顯著差異 （P<0.05），MEBO組和RDEE組相比無明顯差異。

圖1 各組創面愈合率比較Fig.1 Comparison of healing rate in control,MEBO and RDEE group(**:versus control group,P<0.01)

2.2 組織形態學觀察

HE染色顯示，三組均可觀察到創面愈合過程中肉芽組織的各種細胞結構，MEBO組和RDEE組可觀察到較多的成纖維細胞、新生血管和較少的炎性細胞，與對照組有明顯差異。Masson染色顯示，MEBO組和RDEE組比對照組創面肉芽組織中成纖維細胞和新生膠原較多、膠原排列有序（圖2）。

圖2 術后7天各組組織形態學觀察Fig.2 Histological observation of each group 7 days after treatment by HE and Masson staining

圖3 術后7天各組免疫組織化學檢測結果Fig.3 Histochemical observation of each group 7 days after treatment

2.3 免疫組織化學檢測和微血管密度

新生血管形成伴隨創面愈合全過程。CD31為內皮細胞標志物之一。免疫組化染色顯示，MEBO組和RDEE組CD31陽性率較高，與對照組有明顯差異（圖3）。傷后7 d時，三組MVD均呈上升趨勢，MEBO組和RDEE組在術后第11天達高峰，與對照組差異顯著（P<0.05）（表 1）。

表1 各組各時間點MVD的比較Table 1 The comparison of MVD in each group at different time point

2.4 創面組織VEGF表達量的檢測

VEGF是一種對血管生成有極強誘導作用的多功能誘導因子，是已知促血管生成最強的細胞因子。RDEE組VEGF mRNA和VEGF蛋白的表達明顯高于對照組 （P<0.05），MEBO組VEGF mRNA的表達也明顯高于對照組（P<0.05）（圖 4，5）。

圖4 術后第7天各組VEGF mRNA的表達Fig.4 VEGF mRNA expression in each group(**:versus control,P<0.01)

圖5 術后7天各組VEGF蛋白表達Fig.5 VEGF expression in each group by western blot(*:versus control,P<0.05)

3 討論

創面愈合是外科領域的重要問題，是一個復雜而有序的生物過程[11]，主要包括細胞趨化、結締組織細胞增生、細胞外基質蛋白沉積及重排、上皮細胞遷移與增生，最終導致創面再上皮化，恢復組織的完整性和連續性。皮膚結構一旦遭到破壞，組織修復程序開始啟動進行快速有效的修復[12]。傳統理論上將創面愈合人為劃分為三個重疊有序的階段，即：炎癥反應階段、組織細胞增生階段和組織重塑階段。創面再上皮化、創面膠原的沉積和創面血管的新生是創面愈合主要的特征。三者的發生發展相輔相成，又互為條件的。

創面愈合率和愈合時間是最直接而有效的創面愈合評價指標。本實驗采用大鼠背部圓形皮膚切除模型證實，使用龍血竭乙醇提取物軟膏能有效提高創面愈合率和降低創面愈合時間，與對照組相比創面平均愈合時間縮短3.5 d。

膠原沉積增加和新生血管增多有利于促進創面的愈合[13]。膠原代謝在創面愈合中占據重要地位，是構成修復組織的主要細胞外基質成分，為創面修復過程中，組織血管化和上皮化提供支架，對于修復過程的完成有著極其重要的作用。創面愈合過程中，膠原代謝的情況反映了創面愈合的情況[14]。創面新生血管發生于傷后即刻，新生的血管為創傷部位提供氧、營養物質和生物活性物質，并能促進肉芽組織的生長，對創傷修復具有重要作用。微血管的數量關系到組織修復能否得到充足的血流和氧供，若創面有相對足夠的新生血管形成[15]，創面組織將得到充足的營養物質和氧，創面愈合速度將得到加快。本實驗中，HE染色顯示RDEE組炎性細胞浸潤較少、微血管較多，與對照組有明顯差異；Masson染色顯示RDEE組成纖維細胞數量多，膠原排列有序，相對膠原含量明顯高于對照組；MEBO組和RDEE組的MVD逐漸升高，于第11天達到高峰；在第3、7、11天，RDEE組MVD都明顯高于對照組。

此外，許多類型的細胞因子和生長因子與創面愈合過程中的肉芽組織形成、新生血管形成和再上皮化等過程有著密切的聯系[16]，其中VEGF已被證實是唯一對血管形成具有特異性的生長因子。VEGF參與了創面愈合的各個階段，不僅能夠引起細胞外基質成分改變、誘導新生血管形成、減少瘢痕組織的產生和減少感染的發生[17-18]，還可增加血管通透性，促進細胞因子和生長因子的分泌，從而加速創面愈合[19]。本實驗結果顯示，RDEE組VEGF表達明顯高于對照組。

龍血竭為治療皮膚瘡瘍和創傷的常用藥物，具有活血化瘀、去腐生肌、收斂止血等雙向調節作用。現代藥理學研究表明，龍血竭具有良好的活血化瘀、抗氧化、抗菌消炎的生理活性[20-21]。植物藥學成分分析表明，龍血竭乙醇提取物含有黃酮類、三萜類、生物堿類、酚類等化合物。黃酮類和三萜類等植物化學成分已被證實具有抗菌、收斂、抗氧化等作用[22]。因此，對龍血竭提取物有效成分的分離與研究仍需進一步深入。

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