浮游植物葉綠素a4種提取方法的比較

王曼

葉綠素a(chlorophyll a)存在于所有植物中, 是估算水體中浮游植物濃度的重要指標。近年來, 由于中國水體富營養化問題日益嚴重, 浮游植物葉綠素a的測定備受關注。浮游植物葉綠素的測定方法根據測定儀器可分為高效液相色譜法(HPLC法)、熒光光度計法和分光光度計法等, 但上述方法均不適用于快速、大量、野外樣品的分析。目前國內浮游植物葉綠素a的常規測定方法存在測定結果偏低、耗時長、重復測定精密度差等特點, 且在研磨過程中操作人員和丙酮接觸時間長, 不利于實驗人員的健康。因此, 人們通過改變細胞破碎方式、延長提取時間、增高提取液溫度、改變提取溶劑等方法, 對標準方法進行了優化改進。

本文選取丙酮研磨法、凍融法、丙酮加熱法、混合溶劑提取法, 以實驗室培養的水華水樣為實驗對象, 進行葉綠素a的測定研究。從葉綠素a的提取效果、重復操作精密度、操作的簡便性和葉綠素a在提取溶劑中的穩定性等幾個方面對這4種測定方法進行比較, 報告如下。

1 材料與方法

1. 1 水樣準備 將實驗室培養的藻種混合配置成實驗水樣,水樣中含有硅藻屬中的小環藻和菱形藻, 綠藻屬中的小球藻、柵藻、新月藻。水樣配好后立即加入碳酸鎂, 每升樣品加1%的碳酸鎂1 m l, 以防止酸化引起的色素波長偏移。在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜, 將水樣搖勻后分成20份, 每份250 ml,分別抽濾濃縮, 抽完后繼續抽1～2 min, 以減少濾膜上的水分。將濾膜對折后, 夾在濾紙內, 套上黑塑料套, 于-20℃條件下干燥過夜。

1. 2 葉綠素a的提取

1. 2. 1 丙酮研磨法 將冰凍過夜的濾膜取出剪碎放入研缽,加入少量碳酸鎂粉末和90%丙酮10 m l充分研磨(6m l用于研磨 , 4 ml用于潤洗 ), 將樣品轉移至 10 ml具塞離心管中 ,在 4℃冰箱中避光浸提 8～10 h。

1. 2. 2 丙酮加熱法 將90%丙酮在控溫水浴鍋中預熱(55℃)。將冰凍過夜的濾膜取出剪碎放入10m l具塞離心管中, 加入上述預熱的丙酮 10 ml, 在 55℃條件下水浴 2 min, 于 4℃冰箱中避光浸提 2 h。

1. 2. 3 凍融法 將過夜的濾膜取出剪碎放入10 m l具塞離心管中 , 再放入 -20℃冰箱中冷凍 , 每隔 30 min 取出在室溫中解凍 10 min, 反復凍融 3～5 次后 , 離心管中加 90% 丙酮10ml, 振搖 1～2 min 后放入 4℃冰箱避光浸提 , 每隔 30 min 取出振搖1次, 重復3次。在4℃冰箱中避光浸提20 h。

1. 2. 4 混合溶劑法 將過夜的濾膜取出剪碎放入10 m l具塞離心管中, 加入混合提取液10 ml(90%丙酮∶95%乙醇=2∶1;)在 4℃冰箱中避光浸提 8～10 h。

1. 3 比色測定 浸提后將樣品 3 500 r/min 離心 15 min, 取上清液上分光光度計測定, 分別以提取溶劑作為空白, 用1 cm光程的比色皿 , 讀取 750 nm、630 nm、663 nm 和 645 nm 下的吸光度。

葉綠素 a(mg/m3)=[11.64×(D663-D750)-2.16× (D645-D750)+ 0.10×(D630-D750)]V1/Vδ V為樣品體積(L), D為吸光度, V1為提取液定容后的體積 (m l), δ為比色皿光程 (cm)。

2 結果

2. 1 4種方法葉綠素a提取效果的比較 見表1。

2. 2 葉綠素a在不同提取液中穩定性的比較見表2。丙酮研磨法、凍融法、丙酮加熱法的提取液均為90%丙酮, 混合溶劑法的提取液為90%丙酮+95%乙醇。浸提液在4℃冰箱中避光放置0、3天后測定樣品中葉綠素a含量, 用來檢驗葉綠素a在不同提取液中的穩定性。

表1 4種方法葉綠素a提取效果的比較

表2 葉綠素a在不同提取液中穩定性的比較

3 討論

從提取效果和方法精密度來看：凍融法、丙酮加熱法、混合溶劑法測定葉綠素a含量結果及重復測定精密度均高于丙酮研磨法,前3者測定葉綠素a含量結果及重復測定精密度間差異無統計學意義。凍融法的提取效率在四種提取方法中最高, 丙酮加熱法的精密度較好。

從操作耗時來看, 丙酮加熱法提取過程操作簡單、耗時短, 平均僅需2.5h, 能夠滿足大量樣品快速測定的要求?；旌腿軇┓ê捅心シ▽嶒灪臅r相近, 均為9h左右。凍融法耗時太長, 需23h, 無法滿足快速大量測定的要求。凍融法對藻類葉綠素的提取通過兩方面來完成, 一是濾膜在-20 ℃下冰凍, 再在室溫條件下融解, 利用細胞內冰粒的形成和細胞液濃度的增高引起溶漲［1］, 使胞壁結構破碎引起葉綠素溶出；另一方面考慮到反復凍融對藻類細胞的破壁率受到細胞種類、同種藻類不同生長狀況的影響［2］, 因此需采用延長浸提時間來提高提取效率。

葉綠素a測定時要求A(750 nm)應小于0.005。上述4種提取方法的A(750 nm)均值均小于0.005, 但凍融法、丙酮加熱法、混合溶劑和溶劑法的A(750 nm)均低于丙酮研磨法,且較穩定。從葉綠素a在提取液中穩定性來看, 葉綠素a在丙酮和混合溶劑中的穩定性無明顯差異。

目前混和溶劑法較少應用于浮游植物葉綠素a的測定,但從上述分析比較 , 可以看出混和溶劑法提取 8～10 h, 對浮游植物葉綠素a的提取效果較好, 與文獻報道一致［3］。

文獻報道［4］, 單獨用丙酮或乙醇浸提液浸提, 效果都不如混合提取液效果好, 普遍測定值偏低, 這可能和丙酮與乙醇(甲醇)間存在協同萃取效應有關。考慮到提取溶劑對實驗人員健康的影響和葉綠素a在混合溶劑中的穩定性, 目前常用丙酮加乙醇作為混合溶劑, 但兩者的體積比和最優濃度還需進一步的研究確定。

綜上所述, 依據葉綠素a的提取效果、重復操作精密度、操作簡便性以及葉綠素在提取溶劑中的穩定性可知, 丙酮加熱法和混合溶劑法可作為常用的葉綠素a測量方法, 2者尤其適用于大批量水環境樣品的測定。

［1］ 孫利芹,王長海,江濤.紫球藻細胞破碎方法研究.海洋通報，2004 23(4):31.

［2］ 陳勇,劉潔聲, 羅英,等. 不同生長期的塔瑪亞歷山大藻破壁條件和產毒的初步研究 . 環與健康雜志 , 2002, 19(3):175-178.

［3］ 楊敏文.快速測定植物葉片中葉綠素含量方法的探討.光譜實驗室 , 2002, 19(4):478-481.

［4］ 馮菁,李艷波,朱擎,等.浮游植物葉綠素a 測定方法比較.生態環境 , 2008, 17(2):524-527.