膽堿能抗炎通路:缺血性腦卒中炎癥反應的可能調節機制

劉曉潔 梅志剛 王明智 曾永保

(三峽大學醫學院國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室，湖北 宜昌 443002)

我國每年有150萬～200萬新發腦卒中的病例，校正年齡后的腦卒中年發病率為(116～219)/10萬人口，年死亡率為(58～142)/10萬人口，現存腦血管病患者700余萬人，其中約有70%為缺血性腦卒中〔1〕。越來越多的研究資料顯示〔2，3〕，炎癥反應作為缺血性腦卒中病理過程的重要組成部分，貫穿了病理發展的始終，是導致神經損傷的主要原因之一;抗炎治療能使腦梗死的治療時間窗延長，為進一步康復治療贏得寶貴時機。膽堿能抗炎通路(CAP)是新近發現的一種神經免疫調節機制〔4〕，該通路由迷走神經介導，能快速、持續地抑制炎癥因子的釋放，減輕或調節炎癥反應，CAP的發現為腦缺血再灌注損傷的抗炎治療帶來了新的理論指導。本文從缺血性腦卒中與炎癥的關系、CAP對炎癥反應的調節及其在缺血性腦卒中的應用前景做一綜述。

1 缺血性腦卒中與炎癥反應

缺血性腦卒中是由于腦動脈管腔狹窄或阻塞，局部腦血流量減少或突然中斷，造成該動脈供應區的腦組織供血、供氧功能減少或消失，繼而引起繼發性的血管內皮損傷和自主神經功能障礙的一種病理狀態。腦缺血后的炎癥反應主要表現為外周血白細胞在腦實質內浸潤和內源性小膠質細胞激活。研究表明，在腦梗死的超早期或早期，神經元死亡的同時，缺血和再灌注可導致氧自由基的增加和神經元的壞死等，觸發一系列炎癥級聯反應，促進局部炎性細胞因子和趨化因子過度分泌，如白細胞介素(IL)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等釋放，腦血管壁上黏附分子如細胞間黏附分子(ICAM)表達上調，使白細胞被吸引至血管內皮而浸潤腦實質內部并聚集于缺血區，從而激活下游的次級炎癥反應，形成惡性循環〔5～7〕。同時，在腦缺血早期2～4 h后，小膠質細胞被上述炎性細胞因子等激活，多數研究認為激活的小膠質細胞進一步加重了腦損傷〔8〕。

炎癥因子是一組由淋巴細胞、單核巨噬細胞和血管內皮細胞產生的免疫活性分子。當缺血損傷時，促炎因子如IL-1、IL-6、TNF-α和抗炎因子如IL-10等被大量釋放，共同參與機體的應激反應和炎癥調控。IL-1主要分為IL-1α和IL-1β兩種，其中IL-1β在腦卒中過程中的作用尤為重要，它能加重腦損傷，誘發神經細胞凋亡，具有促使炎癥反應并級聯放大的作用〔9〕。動物實驗表明，IL-1β在大鼠大腦中動脈缺血2 h后再灌注0～24 h內逐漸增加，且24 h后達到高峰〔10〕。IL-6是免疫神經系統中參與炎癥反應的重要因子，目前許多實驗都證實IL-6參與了腦卒中的炎癥反應，高濃度的IL-6能使白細胞和內皮細胞的黏附性增強，在腦血腫的形成和血腦屏障的破壞等方面有著重要作用〔11〕。Huang等〔12〕發現腦缺血后 IL-1和 IL-6的升高可以促使血管內皮細胞表達ICAM-1等，介導中性粒細胞聚集于缺血區，從而導致腦組織損傷。ICAM-1是黏附分子中重要的因子之一，核因子κB(NF-κB)與ICAM-1關系密切，ICAM-1的基因上有NF-κB結合位點，激活后的NF-κB可高效誘導ICAM-1的表達，同時 ICAM-1也是 NF-κB活化的重要刺激物之一〔13〕。TNF-α 在炎癥反應中可刺激 IL-1β、IL-6 等表達，引起炎癥反應級聯放大;高表達的TNF-α還具有神經毒性，可加速神經細胞的死亡〔14〕。神經系統中血管內皮細胞、小膠質細胞以及神經元均可產生TNF-α。有研究發現，腦缺血后TNF-α的表達水平增高與神經元的凋亡有關，大鼠大腦中動脈阻斷2 h后，TNF-α mRNA的表達升高，并在4～8 h后表達至高峰且均至少持續24 h，在梗死中心和半暗帶TNF-α表達與凋亡神經元的分布具有一致性〔15〕。

2 CAP

CAP是指中樞神經系統通過膽堿能神經及其遞質調節或抑制炎癥產生的通路。炎癥刺激信號可由傳入迷走神經投射到大腦孤束核(NTS)，通過中樞毒蕈堿乙酰膽堿受體(mAChR)的信號傳導機制，經迷走神經運動背核(DMN)興奮傳出迷走神經，刺激神經末梢釋放乙酰膽堿(Ach)并作用于免疫細胞上的α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)，通過NF-κB和蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導子與轉錄激活子3(JAK2/STAT3)信號通路達到抑制細胞因子和趨化因子的產生與釋放等作用。

2.1 α7nAchR的結構和分布 α7nAchR是煙堿型膽堿能受體的一員，為5個α7亞基構成的同源聚合體，屬于配體門控離子通道。研究發現，α7nAchR在CAP中處于核心地位〔16〕。最初α7nAchR是在神經元細胞上被發現的，隨著迷走神經抗炎通路的提出，巨噬細胞和全身其他很多非神經元細胞(如淋巴細胞、樹突細胞、中性粒細胞、小膠質細胞、上皮細胞、內皮細胞等)表面也發現了α7nAchR〔17〕，而且這些細胞表面的 α7nAchR均可直接參與抗炎作用。

2.2 膽堿能抗炎的信號轉導通路 膽堿能刺激調控炎性細胞因子生成的胞內信號轉導機制目前還不十分清楚，多數認為抑制NF-κB信號通路和激活JAK2/STAT3信號通路是其兩種主要機制〔18〕，見圖 1。

圖1 CAP信號轉導機制示意圖

NF-κB是促炎因子的轉錄因子，是由p65和p50構成的同源或異源二聚體。通常情況下，在細胞質中的NF-κB處于失活狀態，與抑制蛋白IkB(inhibitory protein of NF-κB)結合成三聚體復合物。未磷酸化的IκB是NF-κB的抑制因子，可抑制NF-κB p65/p50的核轉位。炎癥反應過程中，炎癥因子可激活核因子κB抑制蛋白激酶(IKK)，使IκB分子磷酸化，NF-κB發生核轉位繼而與靶基因上的啟動子或增強子的κB結合位點結合，啟動一系列炎癥反應相關基因的轉錄程序，誘導更多的炎癥因子如:ICAM-1、TNF-α、IL-1等高度表達。刺激迷走神經或以膽堿能激動劑激活α7nAchR，可抑制IKK的活性，阻止IκB被磷酸化，從而抑制NF-κB p65/p50的核轉位，抑制炎癥因子的產生〔17，19〕。

JAK2/STAT3通路是抑制促炎因子產生的另一主要機制，它主要由三個成分組成，即酪氨酸激酶相關受體、酪氨酸激酶JAK和轉錄因子STAT。酪氨酸激酶相關受體本身不具有激酶活性，但胞內具有酪氨酸激酶 JAK的結合位點。激活α7nAChR可觸發細胞內結構域的催化活性，募集具有酪氨酸激酶活性的JAK2并使其磷酸化，繼而激活下游的轉錄因子STAT3。活化的STAT蛋白以二聚體的形式進入細胞核內與靶基因結合，調控基因的轉錄，抑制炎癥反應;同時其可以與NF-κB競爭性結合到DNA上，減少TNF-α和IL-6以及高遷移率族蛋白1(HMGB1)等促炎因子的產生〔20〕。

3 缺血性腦卒中抗炎治療及其可能機制

3.1 電刺激迷走神經 目前迷走神經刺激術已被廣泛運用于基礎研究或臨床治療中〔4〕，Ay等〔21〕發現，分別電刺激左側與右側頸部迷走神經均可使急性腦缺血梗死面積明顯減少高達50%左右，并且顯著恢復神經功能評分。進一步深入研究后他們排除了電刺激迷走神經是通過改變腦血流量發揮腦保護作用的可能〔22〕。Zheng等〔23〕得出了同樣的研究結果，他們實驗還發現電刺激迷走神經可減少持久性(permanent)腦缺血梗死面積達38.4%并發揮神經保護作用。據此，上述研究者們認為電刺激迷走神經對腦缺血的腦保護作用可能與抑制了炎癥因子過度釋放有關，而通過何種途徑實現尚不得而知。此外，Bernik等〔24〕觀察到電刺激迷走神經能減輕主動脈阻斷后再灌注損傷所導致的全血TNF-α升高，抑制心臟和肝臟TNF-α生成，緩解缺血再灌注引起的休克。而在其他多種炎癥大鼠模型中(缺血再灌注、出血性休克、膿毒癥等)，通過刺激迷走神經激活CAP均發現可減少因組織損傷而引起的全身或局部的炎癥反應〔18〕。

3.2 穴位針刺 傳統的針刺療法在防治腦缺血炎癥反應方面臨床療效顯著。研究顯示，針刺可顯著降低腦缺血區的IL-1、TNF-α、ICAM-1 mRNA和蛋白表達，發揮抑制炎癥反應和腦保護作用〔25，26〕。在大鼠腦缺血再灌注模型中，孔立紅等〔27〕采用電針“大椎”、雙側“內關”穴，發現其能降低腦缺血再灌注后TNF-α含量，下調NF-κB表達，減輕有害信號轉導對神經細胞的損害。霍則軍等〔28〕發現針刺“后頂”和雙側的“足三里”、“曲池”穴，能降低白細胞數量和血清中TNF-α、IL-6水平，抑制缺血再灌注后的炎癥反應。趙瑛等〔29〕也發現頻率2/15 Hz，強度1 mA的疏密波電針刺激“曲池”、“足三里”穴后能顯著降低誘導型一氧化氮合成酶活性和基質金屬蛋白酶-9含量，減輕腦缺血大鼠的炎癥反應和血管損傷。此外，研究還發現電針刺足三里對內毒素血癥大鼠模型亦具有很好的抗炎效應，但在雙側迷走神經切斷或α銀環蛇毒素阻斷α7nAChR的情況下，電針則失去了抗炎作用〔26〕。Oke等〔30〕認為針刺這種抑制炎癥的作用可能與興奮迷走神經的有關。

3.3 α7nAChR激動劑 尼古丁是一種常見的α7nAChR受體激動劑，煙草中的尼古丁曾被認為是腦卒中的誘發因素之一。可有趣的是，臨床試驗基本證實了尼古丁及其代謝產物作用于α7nAChR，可明顯降低內毒素對人體的損傷，使血清中的IL-10含量升高，并抑制TNF釋放減輕炎癥反應〔31，32〕。但尼古丁不僅作用于α7nAChR，還廣泛作用于其他煙堿受體，因此其副作用很大，這使得臨床上使用尼古丁治療炎癥反應幾乎沒有優勢。而〔3H〕A-585539〔33〕為選擇性 α7nAChR 激動劑，具有很強的血腦屏障通透能力，進入大腦后可選擇性地與α7nAChR結合治療神經變性等疾病。另一種α7nAChR激動劑CNI-1493是一個四價鳥苷腙新藥，臨床前實驗顯示CNI-1493對實驗過敏性腦炎、腦卒中、內毒素休克等多種疾病動物模型的炎癥反應具有抑制作用，其作用可能與激活中樞CAP有關〔34〕。

3.4 其他擬膽堿藥 Kutsuna等〔35〕發現膽堿酯酶抑制劑毒扁豆堿可激活CAP，顯著降低超氧陰離子基團、ICAM-1等含量，抑制大鼠腦缺血再灌注后的早期炎癥反應和血管內皮損傷。Wang等〔36〕發現強效堿酯酶抑制劑石杉堿甲可有效地抑制腦血流灌注不足時TNF-α mRNA的表達并改善慢性炎癥，作者認為其作用可能與CAP密切相關。另外，Lee等〔37〕發現腦室毒蕈堿注射液可降低腦組織水腫含量，降低腦和脾臟平均炎癥介質水平，抑制腦卒中發病過程中的炎癥反應。

4 小結與展望

綜上所述，CAP作為自身控制炎癥反應的神經-免疫性通路，它的發現證明了中樞神經系統可直接參與機體對炎癥刺激的反應調節，是基礎和臨床神經與免疫領域中令人振奮的新發現。正如最早提出CAP理論學說的Tracy教授在《Nature》雜志撰文中提到的，合理性刺激迷走神經可能將是治療炎性疾病的一個很好的治療策略〔38〕，CAP理論的提出還可能會為傳統替代療法作用機制的研究帶來全新理論視角〔30〕。

眾所周知，炎癥反應在腦缺血損傷中扮演了相當重要的角色，及早預防并控制腦缺血及再灌注后的炎癥及其級聯反應在腦卒中預防與康復治療中顯得尤為重要。較多臨床資料證明，包括針刺在內的傳統中醫藥在預防腦缺血，提高腦卒中的治愈率、降低病殘率方面都有較好的療效，且具有較好潛在優勢和廣闊的運用前景。然而實踐中對中醫中藥的運用魚目混珠，參差不齊，缺乏可行的統一標準，加之長期以來人們對中醫中藥抗炎護腦的潛在機制知之甚少，影響了療效的提高和進一步推廣應用，因此探尋其潛在機制，尋找理論突破口勢在必行。

本課題組此前一項研究發現，在預先使用尼古丁和葛根素處理的情況下，腦缺血再灌注模型大鼠出現了神經功能損害明顯減輕，海馬腦組織炎癥細胞浸潤顯著改善，促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低、抗炎因子IL-10含量明顯升高等結果，但在注射α銀環蛇毒素的腦缺血再灌注模型中，葛根素的這些抗炎作用消失，據此，我們推測葛根素防治腦缺血炎癥反應的作用可能是與激活CAP有關〔39，40〕。此外，我們通過電針刺激耳甲區迷走神經分布區穴位“胰膽(CO11)”，在動物模型上觀察到相類似的抗炎作用〔41〕。然而，中醫藥是如何激活CAP，其合理劑量參數和應用時機如何確定，以及抗炎信號轉導機制如何等還有待深入研究。

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