新疆烏魯木齊市耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性及PVL基因檢測

陳 鋒，朱震宏，劉 瀟，劉素輝，武貴臻

（1.新疆醫科大學基礎醫學院病原學教研室，烏魯木齊830011；2.新疆醫科大學第一附屬醫院檢驗科，烏魯木齊830011；3.新疆醫科大學基礎醫學院科研中心，烏魯木齊830011）

金黃色葡萄球菌是目前引起醫院感染常見的病原體，可以引起皮膚軟組織感染、敗血癥和中毒性休克綜合征等多種疾病。從上世紀九十年代末開始，隨著抗菌藥物的廣泛應用以及各種介入性治療方法的應用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染越來越多，成為醫院感染中常見的重要病原菌［1－2］；近年 MRSA引起的社區感染也日見增多，引起社區感染的 MRSA（CA－MRSA）多攜帶殺白細胞素（panton－valentine leukocidin，PVL）基因，主要引起化膿性皮膚感染和壞死性肺炎。MRSA感染具有流行范圍廣、多重耐藥和臨床治療困難等特點，因此了解本地區MRSA的耐藥性對指導臨床用藥和防止其播散有重要意義。本研究的目的是調查新疆醫科大學第一附屬醫院分離的MRSA耐藥性和PVL基因攜帶率，為臨床治療及控制MRSA感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 49株MRSA菌株為2011年3～10月從新疆醫科大學第一附屬醫院門診和住院患者分離所獲得的臨床分離菌株；質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，來自新疆醫科大學微生物教研室。

1.2 試劑 藥敏試驗用培養基M－H瓊脂購自杭州微生物試劑廠，青霉素G、苯唑西林、紅霉素、慶大霉素、利福平、呋喃妥因、阿奇霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、克林霉素和萬古霉素等藥敏紙片均購自英國Oxoid公司，引物由上海生工合成，PCR試劑盒購自上海生工，細菌DNA提取試劑盒購自天根生物公司。

1.3 方法

1.3.1 MRSA的鑒定 將臨床標本接種于血平板進行分離培養，通過革蘭染色、溶血性、血漿凝固酶試驗和甘露醇發酵試驗進行金黃色葡萄球菌的鑒定；通過表型和基因型檢測進行MRSA鑒定。表型檢測：采用頭孢西丁紙片法，抑菌圈小于或等于21判斷為MRSA。基因型檢測：按試劑盒說明提取細菌DNA，采用PCR法檢測mecA基因。2012年臨床和實驗室標準協會（CLSI）指出：MRSA的分子生物學檢測方法中最準確的方法是檢測mecA基因或其編碼蛋白青霉素結合蛋白－α（PBP－α），即mecA基因陽性者判定為 MRSA。mecA基因上游引物序列為5′－TGG CTA TCG TGT CAC AAT CG－3′，下游引物序列為5′－CTG GAA CTT GTT GAG CAG AG－3′，擴增片段為310bp。

1.3.2 藥敏試驗 采用紙片擴散法測定MRSA對10種抗菌藥物的敏感性，萬古霉素用微量肉湯稀釋法，參照CLSI 2009年標準操作進行判讀。

1.3.3 PVL基因檢測 按試劑盒說明提取細菌DNA。上游引物序列為5′－ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A－3′，下 游 引 物 序 列 為 5′－GCA TCA AGT GTA TTG GAT AGC AAA AGC－3′，擴增片段為433bp［2］。PCR反應體系為20μL：PCR Master 10μL，引物各1μL，模板DNA 3μL，dH2O 5μL；反應條件為94℃預變性5min，然后94℃變性50s，55℃復性50s，72℃延伸1min，共循環30次，最后72℃延伸5min。取擴增產物5μL進行瓊脂糖（2%）凝膠電泳（100V，30min），于紫外燈下觀察結果并照相記錄。質控菌株為ATCC49775。

2 結 果

2.1 MRSA的檢測 49株MRSA菌株均對頭孢西丁耐藥，均表達mecA基因，見圖1。

圖1 mecA基因PCR擴增電泳圖

2.2 藥敏試驗結果 49株MRSA對青霉素G和苯唑西林100.0%耐藥，對利福平耐藥率高達95.9%，對阿奇霉素、紅霉素、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星和克林霉素表現出不同程度的耐藥，其耐藥率分別為77.8%、77.8%、88.9%、86.7%、83.67%和67.35%，對呋喃妥因耐藥性僅為2.2%，對萬古霉素全部敏感。

2.3 PVL基因檢測 49株MRSA僅31株檢出PVL基因，占63.3%，MRSA菌株PVL基因檢測結果，見圖2。

圖2 PVL基因PCR結果

3 討 論

MRSA是醫院感染的重要病原菌，對目前臨床應用的大多數抗菌藥物有很高的耐藥率，給臨床治療帶來困難，已成為世界范圍內耐藥監測的重點。本次藥敏結果顯示，新疆醫科大學第一附屬醫院臨床分離的49株MRSA具有多重耐藥性，對青霉素G和苯唑西林均耐藥，對利福平、紅霉素、慶大霉素、阿奇霉素和阿米卡星均有較高的耐藥率，尚未發現對萬古霉素耐藥的菌株。結果表明烏魯木齊地區MRSA耐藥現象比較嚴重，呈多重耐藥，僅對萬古霉素敏感性較好，與文獻報道的結果一致，故烏魯木齊地區應該加強對MRSA耐藥性的監測，并根據藥敏試驗結果合理使用抗菌藥物，也可以考慮聯合用藥以降低抗菌藥物的使用劑量，避免耐藥現象的發生。

PVL可通過改變細胞膜通透性殺傷白細胞，體外試驗表明PVL尚可通過線粒體途徑誘導白細胞凋亡［3］。目前普遍認為PVL是引起金黃色葡萄球菌皮膚軟組織感染及壞死性肺炎的重要毒力因子，產生PVL的金黃色葡萄球菌更容易穿過皮膚引起嚴重感染［4］，動物實驗也證實了這一點［5－6］，但也有相反的觀點［7］。PVL在CA－MRSA）中有較高的攜帶比例，其陽性被認為是CA－MRSA的分子生物標志。國外報道在CA－MRSA中PVL基因陽性率在80%以上［8］，而在醫院相關性 MRSA（HA－MRSA）中陽性率較低。國內張楠等［9］報道寧夏地區PVL陽性率僅為9.1%，王風玲等［10］、孫桂珍等［11］報道 MRSA的PVL陽性率分別為46.8%、40.0%，表明產PVL的MRSA在我國臨床已占有較高的比例，應引起臨床高度重視。在本研究中49株PVL陽性率高達63.3%，而且這些菌株也表現出對紅霉素、克林霉素、慶大霉素等抗菌藥物的多重耐藥性，這與潘宏升等［12］的報道一致。而PVL基因對 MRSA耐藥性是否有影響尚有待進一步研究。

新疆是我國艾滋病的高發地區，HIV感染被認為是MRSA定植［13］、感染［14］的危險因素。因此，檢測烏魯木齊地區MRSA的耐藥性及毒素基因可為臨床正確使用抗菌藥物治療以及更好地控制MRSA感染提供科學的指導依據。

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