高效液相色譜法測定嬰兒奶粉中維生素B12

農云軍，王 飛*，竇文淵，石燕麗

（中國廣州分析測試中心 廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東 廣州 510070）

維生素B12（VB12）又叫鈷胺素，是一類含有咕啉類化合物的總稱，能溶于水、乙醇和甲醇，不溶于氯仿、丙酮和乙醚。維生素B12的主要生理功能是參與制造骨髓紅細胞，防止惡性貧血和大腦神經受到破壞[1-3]。人體需要的維生素B12的量很少，推薦的日補助量為2.4μg，懷孕和哺乳的婦女需要量為2.6μg，嬰兒為0.4μg。食用過量可能引起過敏反應，甚至過敏性休克；攝入不足則可能引起惡性貧血，骨髓變性，神經系統癥狀等，因此準確控制維生素B12的含量尤為重要。

目前測定維生素B12的方法主要有分光光度法[4-6]、酶聯免疫法[7]、微生物法[8]及高效液相色譜法[9-12]。分光光度法比較傳統，檢出限高；酶聯免疫法成本高，國內還不夠成熟；微生物法靈敏度較高，但由于操作繁瑣，檢測周期長，重復性差而不能被廣泛應用。文獻中雖然也有用液相色譜法測定維生素B12，但基質多為單一組分或是含量較高的保健食品，對于基質復雜，含量低（強化值不小于0.8μg/100g[13]）的配方奶粉，不能滿足檢測要求；近來有2篇文獻[14-15]報導測定奶粉中的VB12含量，但是采用價格昂貴的高效液相色譜-質譜聯用儀，不適于普通實驗室使用。本研究主要針對嬰兒奶粉樣品，采用簡單方便的前處理手段，結合普通的反相高效液相色譜法（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）達到檢測嬰兒奶粉中維生素B12含量的目的。本方法具有簡單、快速、結果可靠、成本低等優點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素B12：美國Sigma公司；乙醇、乙腈（色譜純）：廣州試劑廠；實驗用水為二次蒸餾水。嬰兒奶粉：市售。

1.2 儀器與設備

島津LC-20A液相色譜儀（包括兩元梯度泵，自動進樣器、控溫箱、控制系統）、2489紫外可見檢測器、島津LC solution色譜工作站：日本島津公司。KQ-600型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：C18（4.6mm×250mm，2.5μm）；流動相A：水，流動相B：乙腈；梯度程序：0～10min，B相為5%；10min～25min，B相由5%升至35%；25min～30min，B相為35%；30min～36min，B相為5%。柱溫為35℃，流速為1.0mL/min，檢測波長550nm。

1.3.2標準溶液的配制

維生素B12標準儲備液：準確稱取維生素B1210mg，置于100mL容量瓶中，用蒸餾水溶解定容，配制成100μg/mL的標準儲備液。

維生素B12標準工作液：取適量的標準儲備液用蒸餾水稀釋至50mL，分別配制成0.010μg/mL、0.050μg/mL、0.100μg/mL、0.500μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、系列標準工作溶液。

1.3.3 樣品處理

精密稱取樣品10.0g，用100mL 80%vol的乙醇分3次超聲提取（50mL、30mL、20mL），每次超聲15min，提取液離心，合并上清液和洗液置于燒瓶中，于80℃水浴中減壓濃縮至干，殘渣用蒸餾水溶解定容5.00mL，冷凍離心后，取上清液過0.45μm濾膜，上機待測。

2 結果與討論

2.1 樣品的提取純化和富集

奶粉成分復雜，其中維生素B12的含量只有1.5μg/100g左右，未經純化和富集的樣品，根本不可能用高效液相色譜完成其含量的測定。在提取、純化和富集的過程中，發現影響維生素B12提取的主要因素是奶粉中含有大量的糖和蛋白質，但是因為糖和蛋白質也是水溶性的化合物，很難將其和維生素B12分離開來。經過反復實驗和摸索，確定樣品用80%vol的乙醇作為提取溶劑效果最好，此時，奶粉中的糖分和蛋白質同時被沉淀下來，而維生素B12能溶于80%vol的乙醇中，很大程度地純化了提取過程，無需再用固相萃取技術（solid phase extraction，SPE）富集凈化[11-12]，大大降低了前處理的成本。

通過優化多個提取參數，最終確定稱取10g嬰兒奶粉樣品，用100mL 80%vol的乙醇分3次超聲提取（50mL、30mL、20mL），每次15min，離心合并濾液和洗液，于80℃水浴中減壓濃縮至干，最后殘渣用蒸餾水溶解定容，冷凍離心，取上清液過濾后待測。

2.2 色譜條件的選擇和優化

維生素B12的水溶液在278nm、361nm和550nm 3個波長處有紫外吸收，278nm和361nm波長位于紫外區，雖然吸收較強，但干擾物質多，目標峰很難判斷，結果不穩定。本實驗選擇可見區的550nm作為檢測波長，在維生素B12目標峰前后10min的范圍內沒有其它色譜峰的干擾，根據實驗室的實際情況，反復摸索實驗條件最終確定采用普通的C18反相色譜柱，以水-乙腈體系作為流動相，溶劑背景噪聲最低。

改變流動相體系中水和乙腈的比例，對維生素B12的峰形和出峰時間都有一定的影響，如果用15%乙腈作為流動相，等度洗脫，維生素B12在5.5min就流出了色譜柱，此條件適用于維生素B12含量較高的保健品，對于成分復雜的奶粉達不到好的分離效果。流動相體系中水的加入量主要影響維生素B12的出峰時間，增大水的比例，維生素B12出峰加快，目標峰和雜質的分離度會降低，不利于定量分析。實驗結果表明，采用梯度洗脫（流動相A：水，流動相B：乙腈；梯度程序：0～10min，B相為5%；10min～25min，B相由5%升至35%；25min～30min，B相為35%；30min～36 min，B相為5%），使雜質先出峰，能形成較好的分離效果，色譜峰對稱性好，保留時間適中，適用于定量分析。標準品及樣品維生素B12檢測色譜見圖1。

圖1 標準品(A)和(B)奶粉中維生素B12的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of VB12in standard(A)and sample(B)solution

2.3 線性范圍和檢出限

取不同質量濃度的標準品溶液，在選定的色譜條件下測定，以峰面積（Y）為縱坐標，標準品質量濃度（X）為橫坐標作圖，得線性回歸方程為Y=41829X-1282，相關系數r為0.9998。線性范圍為0.010μg/mL～10μg/mL，檢出限為0.1μg/100g，信噪比（signal to noise ratio，S/N）為3。

2.4 精密度實驗

用0.10μg/mL的維生素B12標準溶液，進樣50μL，連續進樣6針，結果見表1。保留時間和峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.074%和1.56%。

表1 精密度實驗結果（n=6）Table 1 Results of precision tests(n=6)

2.5 平行性實驗

按照1.3.3方法處理方法，嬰兒奶粉均勻取樣6份，按照上述色譜測定條件對其中的維生素B12含量進行測定，結果見表2，相對標準偏差為3.56%。

表2 平行性實驗結果Table 2 Results of parallel tests

2.6 回收率實驗

取嬰兒奶粉樣品，在最佳的實驗條件下，按照1.3.3方法處理樣品，同時按加入本底平均值約50%～150%的標準品做回收率實驗，結果見表3。加標回收率范圍為78.8%～84.0%，相對標準偏差為3.18%～3.82%，平均加標回收率為80.9%。

表3 回收率測定結果（n=5）Table 3 Results of recovery rate tests(n=5)

3 結論

本實驗采用RP-HPLC方法測定奶粉中維生素B12的含量，方法的線性范圍為0.010μg/mL～10μg/mL，相關系數為0.9998，檢出限為0.1μg/100g，加標回收率為78.8%～84.0%，相對標準偏差為3.18%～3.82%。該方法前處理簡單、分析成本低，靈敏度高，可用于實際樣品的測定，結果令人滿意，為從事食品安全檢測人員提供了一定的參考信息，在保障食品安全和人民身體健康方面有著重要的意義。

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