考馬斯亮藍法測定核桃水溶性蛋白含量的研究

柳 蔭，吳鳳智，陳 龍，王曉丹，邱樹毅，周鴻翔*

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

近年來，基因工程學、分子生物學和現代分離技術快速發展，蛋白質也作為一項質量和資源評價的指標[1]，目前測定蛋白質含量的常用方法有凱氏定氮法、考馬斯亮藍（coomassie brilliant blue，CBB）染色法、紫外分光光度法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法（Lowry法）等[2-3]，有關文獻報道CBB法優于其他的方法[4-7]。

牛血清白蛋白是極為常用的標準參照蛋白，其質量限定條件一般要求蛋白質含量在80%以上（凱氏定氮法測定）。在10d～50d范圍內，以凱氏定氮法測定的牛血清白蛋白質含量未見明顯規律性變化，但呈下降趨勢；而氨基酸含量呈逐漸增加趨勢，表明在4℃條件下牛血清白蛋白存在降解現象[8-9]。因此，牛血清白蛋白溶液配好盡快做標準曲線。

在利用分光光度計測量吸光度值時，所用的比色皿應該是塑料的或玻璃的。并且用之前應絕對保證清洗干凈，禁止使用石英（成分為二氧化硅）比色皿，因為染料會跟二氧化硅發生共價結合[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品為核桃蛋白（實驗室自制）；牛血清白蛋白：購于Solarbio公司；考馬斯亮藍G-250：購于Beyotime公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV2550紫外可見分光光度計：日本島津公司；TDL-40B離心機：上海安亭科學儀器廠；FW177粉粹機：天津泰斯特儀器有限公司；101-3A鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；JA1003N電子精密天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗原理

考馬斯亮藍G-250存在著紅色和藍色2種不同的著色形式。蛋白質分子具有酰胺基結構，其和蛋白質通過分子間范德華鍵結合，染料與蛋白質結合后顏色由紅色形式轉變成藍色形式，最大吸收波長由465nm變成595nm，通過測定波長595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量[11-13]。

1.4 實驗方法

1.4.1 考馬斯亮藍G-250的制備[14-15]

精確稱取100.00mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL90%vol乙醇中，加入100mL85%的磷酸，用水稀釋至1000mL。快速過濾后，放在棕色試劑瓶中避光保存。最終試劑中含0.1g/L考馬斯亮藍G-250，47g/L乙醇，85g/L磷酸。

1.4.2 標準蛋白質溶液的制備

結晶牛血清白蛋白，預先經微量凱式定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度配制成1mg/mL標準溶液。

1.4.3 供試樣品溶液的制備

精確稱取處理好的核桃粗蛋白粉0.5002g，加入蒸餾水溶解，在室溫條件下攪拌浸提1h，然后3500r/min離心20min，過濾上清液。然后加少量蒸餾水對沉淀進行再次水提，操作條件與前者相同。合并2次所得的上清液，定容至100mL，備用。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程建立

取9支試管，分別加入0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL的1mg/mL標準蛋白質溶液，補水至2.0mL。另取9支試管，分別加入0.1mL以上溶液，然后各加入5mL考馬斯亮藍試劑，充分振蕩混合，10min后于波長595nm處，以0號管為空白，測定各管的吸光度值。以標準蛋白質濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖1。

得其線性回歸方程式：

Y=0.87249X-0.00056，R2=0.99964，r=0.99982

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 Protein standard curve

2.2 供試樣品中蛋白質含量的測定

取樣品溶液0.1mL于試管中，各加入5mL考馬斯亮藍試劑，充分混合，放置10min，以試劑空白為對照，波長595nm處比色，測定吸光度值。同時做3個重復，測得吸光度值分別為0.372、0.377、0.345，計算蛋白質含量分別為8.54%、8.66%、7.92%，平均含量為8.37%。

2.3 穩定性實驗

量取同一樣品溶液0.1mL，每隔5min測定一次，觀測其穩定性，結果見表1。

表1 穩定性實驗結果Table 1 Results of stability experiment

由表1可知，在顯色5min～25min內吸光度值比較穩定，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.67%，小于5%，表明穩定性較好。

2.4 精密度實驗

精確吸取牛血清白蛋白溶液0.1mL進行精密度實驗，連續測定其吸光度值6次，結果見表2。

表2 精密度實驗結果Table 2 Results of precision experiment

由表2可知，RSD為1.62%，小于5%，表明精密度較好。

2.5 重現性實驗

精確吸取來自同一批原料的試樣，按樣品測定方法，分別測定其吸光度值，結果見表3。

表3 重現性實驗結果Table 3 Results of reproducibility experiment

由表3可知，RSD為2.36%，小于5%，表明重現性較好。

2.6 回收率實驗

精確吸取已配制的樣品溶液1mL，分別加入0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL蛋白質標準溶液，加蒸餾水補足至2.0mL，按照樣品測定法測吸光度值，計算回收率，結果見表4。

表4 回收率實驗結果Table 4 Results of recovery rate experiment

由表4可知，RSD為2.77%，小于5%，表明該方法準確度較高，實驗方法可行。

3 結論

供試樣品溶液中蛋白質含量為0.1mg/mL～0.8mg/mL內時，在25min之內用考馬斯亮藍染色法測定其中的蛋白質含量，方法簡便快速、靈敏度高、重現性好，對設備要求低，是測定蛋白質的有效方法。

[1]王孝平，邢樹禮.考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J].天津化工，2009，23（3）：40-41.

[2]寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京：中國輕工業出版社，1997.

[3]劉小華，張美霞，于春梅，等.考馬斯亮蘭法測定殼聚糖中蛋白的含量[J].中國交通醫學雜志，2006，20（2）：159-160.

[4]李 娟，張耀庭，曾 偉，等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學雜志，2000，13（2）：118-120.

[5]王衛國，吳 強，胡保坤，等.幾種測定灰樹花多糖中蛋白質含量方法的比較研究[J].中國食用菌，2003，22（1）：27-30.

[6]王愛軍，王鳳山，王友聯，等.低濃度蛋白質含量測定方法的比較[J].中國生化藥物雜志，2003，24（2）：78-80.

[7]王淡兮，孫秀蘭.蛋白質定量檢測方法的探討[J].糧食與食品工業，2009（4）：49-52.

[8]陳曉梅，劉雅文，程 熠，等.考馬斯亮藍法蛋白定量標準曲線穩定性觀察[J].中國公共衛生雜志，2006，22（3）：380-381.

[9]李聞捷，范華杰，蔡 剛.蛋白質定量方法的局限性及合理應用[J].臨床檢驗雜志，2004，22（3）：210.

[10]CHIAL H J,THOMPSON H B,SPLITTGERBER A G.A spectral study of the charge forms of coomassie blue G250[J].Anal Biochem,2003,209(2):258-266.

[11]ZUO SS,LUNDAHL P A micro-Bradford membrane protein assay[J].Anal Biochem,2005,284(1):162-164.

[12]王文平，郭祀遠，李 琳，等.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質的含量價[J].食品研究與開發，2008，29（1）：115-117.

[13]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976,72(1-2):248-254.

[14]王福榮.生物工程分析與檢驗[M].北京：中國輕工業出版社，2010.

[15]李建武.生物化學實驗原理和方法[M].北京：北京大學出版社，1991.