擬康氏木霉胞外總多糖免疫活性研究

李麗華，喻麗珍，趙志剛，王國棟

（皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 蕪湖 241002）

真菌多糖是自然界中存在種類較多、生物活性較高的一類活性多糖，是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn)[1].此類多糖具有很強(qiáng)的生物活性，主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗衰老、抗氧化等方面，在國際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[2]”.

擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）是從玉米秸稈中分離的一株木霉，屬于真菌類半知菌亞門、絲胞綱、木霉屬.擬康氏木霉胞外多糖（Extracellular polysaccharides of trichoderma pseudokoningii,TPeps）是采用液體發(fā)酵法，從擬康氏木霉中得到一類結(jié)構(gòu)新穎的多糖.魏廣金[3]從該多糖中分離得到兩個(gè)組分TPeps-1和TPeps-2，并和郭敏等通過實(shí)驗(yàn)證明，這兩個(gè)組分可提高番茄和黃瓜葉片水楊酸含量，激活植物的活性氧爆發(fā)使之產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性及系統(tǒng)抗性，起到預(yù)先免疫的作用[4-6].孔夢麗[7]發(fā)現(xiàn)TPeps-1能增強(qiáng)小鼠的免疫功能，黃濤濤[8]的研究則表明[7]TPeps-1體外能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，抑制白血病細(xì)胞K562的增殖.

上述文獻(xiàn)說明擬康氏木霉胞外多糖的兩個(gè)單一組分特別是TPeps-1體內(nèi)外具有多種生物學(xué)活性，但有關(guān)該總多糖實(shí)驗(yàn)或報(bào)道則甚少或空缺，為了探索擬康氏木霉胞外總多糖是否具有良好的免疫活性，我們開展了本文中的實(shí)驗(yàn)研究.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬康氏木霉胞外總多糖（TPeps）：實(shí)驗(yàn)室自制；注射用環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；綿羊紅細(xì)胞：蕪湖市衛(wèi)生防疫站.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠180只，雌雄各半，(20±2)g，購于南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場.

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥方法

昆明種小鼠，按體重隨機(jī)分成隨機(jī)分成4組：模型組、TPeps低、中、高劑量組，每組12只.同時(shí)另取12只作正常對照組，其中模型組和正常對照組按20ml/kg體重的容積灌胃生理鹽水，三個(gè)給藥組分別按 50、100、200mg/(kg·d)劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7天.

1.3.2 免疫低下動(dòng)物模型的建立

除空白對照組外，上述各組小鼠均于第1、2、3天腹腔注射新配制的環(huán)磷酰胺70mg/kg，造成免疫低下動(dòng)物模型.

1.3.3 對非特異性免疫功能的影響—碳粒廓清法[10]

上述五組小鼠末次給藥后，立即給予20%的印度墨汁0.1m l/10g尾靜脈注射，并分別于第2分鐘及第10分鐘后進(jìn)行眼眶取血20μl，將所取眼眶血加入到盛有2ml的0.1%碳酸鈉溶液試管中，于680nm處測其吸光度值.將小鼠處死，取其肝臟、脾臟并稱重，根據(jù)以下公式計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù).

臟器指數(shù)＝臟器重量（mg）/小鼠體重（g）

1.3.4 對體液免疫功能的影響—血清溶血素法[11]

給予五組小鼠每日腹腔注射0.2ml的20%綿羊紅細(xì)胞致敏.末次給藥后1小時(shí)，對小鼠進(jìn)行眼球取血，并分離血清.將50μl血清以生理鹽水稀釋500倍.取稀釋后的血清1m l、5%的綿陽紅細(xì)胞0.5m l及10%的豚鼠血清1m l放入試管混勻，置于37℃水浴保溫10分鐘，然后轉(zhuǎn)移至冰浴中終止反應(yīng).以3000轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液1ml加入都氏試劑3m l，混勻后室溫放置10分鐘，于540nm處測定吸收值.另外取試驗(yàn)用的經(jīng)過洗滌的5%綿羊紅細(xì)胞0.25ml，加3.75m l都氏試劑，混勻后室溫放置10分鐘，540nm處比色，所得值即為綿羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血時(shí)的吸收度值.

樣品的半數(shù)溶血值（HC50）=（樣品的吸收度值/綿羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血時(shí)吸收度值）×500

1.3.5 對細(xì)胞免疫功能的影響—DTH法[11]

各組小鼠給藥第3日同時(shí)致敏.腹部脫毛，在脫毛處涂于1%二硝基氟苯（DNFB）25μl，次日強(qiáng)化，致敏第4日右耳涂以DNFB 10μl進(jìn)行攻擊.24小時(shí)后將小鼠處死，用打孔器取下左右耳片，稱重，以左右耳片之差表示DTH強(qiáng)度.

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均用SPSS軟件分析，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用T檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 對非特異性免疫功能的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射70mg/kg環(huán)磷酰胺能顯著抑制小鼠的免疫功能，而TPeps50、100mg/kg劑量組能顯著提高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)，其中100mg/kg劑量組還能提高脾指數(shù)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明TPeps具有增強(qiáng)非特異性免疫功能的作用.見表1.

表1 TPeps對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響（)

表1 TPeps對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響（)

與正常組比較 aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較 cP＜0.01(以下同)

組別 動(dòng)物數(shù)/n 劑量/（mg/kg·d） 胸腺指數(shù)/mg·g 脾指數(shù)/mg·g正常組 12 4.15±0.49 11.04±1.03模型組 10 1.34±0.54c 6.71±1.32c TPeps低劑量組 12 50 1.82±0.51a 7.15±1.28 TPeps中劑量組 11 100 1.91±0.39b 7.91±1.34a TPeps高劑量組 10 200 1.45±0.48 6.56±1.12

2.2 對體液免疫功能的影響

TPeps低、中劑量組可使免疫低下的小鼠溶血素水平呈顯著回升趨勢，與模型組比較差異顯著（P<0.01），表明該多糖對體液免疫功能有增強(qiáng)作用.見表2.

表2 TPeps對免疫低下小鼠血清溶血素含量的影響()

表2 TPeps對免疫低下小鼠血清溶血素含量的影響()

/n 劑量/血清溶血素組別 動(dòng)物數(shù)（mg/kg·d）/HC50正常組 12 511.3±50.9模型組 10 309.9±77.5c TPeps低劑量組 11 50 372.9±37.6a TPeps中劑量組 12 100 397.3±46.2b TPeps高劑量組 11 200 369.6±71.7

2.3 對細(xì)胞免疫功能的影響

結(jié)果顯示，TPeps低、中劑量組可使免疫抑制的小鼠DTH反應(yīng)升高，與模型組比較具有明顯差異（P<0.05），表明該多糖具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的作用.見表3.

3 討論

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，擬康氏木霉胞外總多糖50～200μg/mL濃度能夠有效刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，但低濃度刺激并不明顯.此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示該多糖低、中、高三個(gè)劑量組，其中50mg/kg和100mg/kg劑量組增強(qiáng)免疫功能的作用較強(qiáng)，而200mg/kg劑量組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)殡S著劑量的加大，多糖的溶解度降低所致.

表3 TPeps對免疫低下小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)的影響(，n=10)

表3 TPeps對免疫低下小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)的影響(，n=10)

/（mg/kg·d） 耳殼重量/mg DTH組別 劑量 右 左 強(qiáng)度正常組 13.9±1.55 10.6±0.74 3.3±1.86模型組 11.7±1.53 10.5±1.17 1.14±1.24c TPeps 低劑量組 50 12.8±0.91 10.7±0.67 2.13±0.84a TPeps 中劑量組 100 12.4±0.69 10.1±0.57 2.26±0.89a TPeps 高劑量組 200 11.9±1.09 10.1±1.08 1.75±1.14

通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，擬康氏木霉胞外總多糖也有較好的增強(qiáng)免疫的功能，它在免疫方面的突出表現(xiàn)，也預(yù)示著其可能具有一定的抗腫瘤作用.此外，我們的前期實(shí)驗(yàn)也表明該多糖體外確實(shí)具有一定的抗癌活性.但有關(guān)該總多糖免疫活性的系統(tǒng)研究及與其單一組分的免疫活性比較，免疫活性和抗腫瘤作用之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步探索.

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