2011年湖南省水稻矮縮病病原的RT-PCR檢測和病害分級

徐志德，李 舒，劉建軍，劉見平，劉都才，周國輝

（1.湖南省植物保護研究所，湖南 長沙410125；2.華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣東 廣州510642；3.常德市鼎城區(qū)農(nóng)業(yè)局，湖南 常德415100）

由南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑條矮縮病是近年來南方地區(qū)新發(fā)生的一種重要水稻病害。該病暴發(fā)性強，擴展蔓延快，危害大，目前在湖南省普遍發(fā)生。2009年湖南省南方水稻黑條矮縮病發(fā)病面積達數(shù)萬hm2，經(jīng)濟損失達數(shù)千萬元。2009～2012年對湖南省的主要水稻栽培品種的抗病性、發(fā)病程度和癥狀類型等進行了全面調查和研究[1-3]。2010年湘南局部地區(qū)南方水稻黑條矮縮病發(fā)生嚴重，如江華瑤族自治縣中稻發(fā)病面積9 333 hm2，平均病叢率達60%。根據(jù)病害發(fā)生規(guī)律，湖南省水稻可能受到多種病毒的侵染，近年SRBSDV、RRSV和RBSDV發(fā)生的可能性較大，這3種病毒引致的田間癥狀較為相似，田間調查時容易混淆。為明確上述3種病毒在湖南省的發(fā)生與分布情況，2011年在湘北、湘中和湘南各選1個縣，采集了72個表現(xiàn)矮縮病癥狀的中晚稻病株樣品，對其進行了SRBSDV（由白背飛虱傳播）和水稻病原病毒水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV，由褐飛虱傳播）的RT-PCR檢測，并對其中10個有代表性的樣品進行了普通水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV，由灰飛虱傳播）檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年8～10月，從湖南省湘北的常德、湘中的長沙和湘南的永州共計采集了中晚稻水稻秧苗、植株、稻谷等72個表現(xiàn)矮縮病癥狀的病株樣品，并根據(jù)癥狀表現(xiàn)對樣品進行分類描述。

1.2 方法

1.2.1 總RNA抽提 取所采病害樣品的葉片進行RNA抽提。每個樣品取1 g左右，加入10粒直徑2.5mm的玻璃珠和700μL Rnaiso Plus提取液，用Mini Bead Beater充分研磨1.5min；加氯仿500 μL劇烈振蕩15 s，冰浴10 min，4℃、12 000 r/min離心15min；取其上清液再加氯仿500μL劇烈振蕩15 s，冰浴10 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取其上清液加等體積的異丙醇約400μL輕微晃動，-20℃靜置15 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；棄其上清液，加80%DEPC乙醇1 mL，-20℃旋轉混合；棄其上清液，再加無水乙醇1 mL，-20℃旋轉混合；棄其上清液風干10 min，加100 μL DEPC ddH2O，輕彈溶解。將抽提得到的總RNA于-20℃保存。

1.2.2 RT-PCR檢測 根據(jù)已報道的SRBSDV和RRSV基因組序列，分別設計了2對SRBSDV特異引物（S5-OF/S5-OR、S10-OF/S10-OR）用于該病毒的雙重檢測；1對RRSV特異引物（RRS8+/RRS8-）和1對RBSDV特異引物（RBSDV+/RBSDV-），用于相應病毒的檢測（表1）。

表1 引物信息

一步法RT-PCR以稻株樣品的總RNA為模板，采用TaKaRa公司的PrimeSprit One Step RTPCR KiT Ver.2試劑盒進行。其25μL反應體系含有12.5μL 2×Reaction buffer，1μL 10μmol/L上、下游引物，0.5μL 40 U/μL RTase，1μL總RNA模板，9μL RNase-free H2O。RT-PCR熱循環(huán)條件為：50℃30min；94℃預變性2 min；94℃變性30 s，52℃復性30 s，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增完成后，取5μL RT-PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察檢測結果。對檢測為陽性的樣品，將其RT-PCR產(chǎn)物交由上海英駿生物技術公司進行純化和直接測序，并對檢測結果進行驗證。

1.2.3 病害分級 2010年從大田中割取不同株高的水稻植株，在實驗室仔細辨認植株病害癥狀后，再按株高分為無病株、有癥狀但矮縮不明顯、有癥狀矮縮約1/4、有癥狀矮縮約1/3、有癥狀矮縮約1/2等5類，再詳細考查株高、實粒數(shù)、空粒數(shù)和千粒重等性狀。根據(jù)項數(shù)不相等成組數(shù)據(jù)的平均數(shù)t測驗，對株高、實粒數(shù)和空粒數(shù)進行t測驗，t測驗不顯著的植株再重新調整分組，直到3個性狀的t測驗全部達顯著為止。

2 結果與分析

2.1 田間病害樣品的癥狀觀察

田間采集的矮縮病株癥狀有4種主要類型。（1）植株矮化、葉片皺縮、莖稈有蠟淚、有倒生氣生根、有高位分蘗，這是典型病株癥狀。（2）植株矮化、葉片皺縮、莖稈有蠟淚、有倒生氣生根、無高位分蘗。湘中長沙采集的矮縮病株該癥狀較多。（3）植株矮化、葉片皺縮、有高位分蘗、無倒生氣生根、莖稈無蠟淚。湘北常德采集的矮縮病株該癥狀較多。（4）植株不矮化、葉片皺縮、有倒生氣生根、有高位分蘗、莖稈無蠟淚。湘中長沙溫室中采集的矮縮病株該癥狀較多。此外，還有只植株矮化；只有倒生氣生根；植株矮化、有倒生氣生根；葉片皺縮、有倒生氣生根；葉片皺縮、有高位分蘗等幾種癥狀類型，但數(shù)量不多。

2.2 RT-PCR檢測

RT-PCR檢測及產(chǎn)物測序結果表明，采集的72個樣品中有14個（19.44%）含有SRBSDV（圖1），此結果與張松柏的研究結果一致[4]。所有樣品均未檢出RRSV。另從未檢出SRBSDV的樣品中根據(jù)不同癥狀選取10個有代表性的樣品進行RBSDV檢測，亦未檢出該病毒。

圖1 部分樣品的SRBSDV雙重RT-PCR檢測

72個檢測樣品中，表現(xiàn)出第1種癥狀的樣品有14個，其中9個（64.3%）檢出帶毒；表現(xiàn)出第2種癥狀的樣品有23個，其中3個（13.0%）檢出帶毒；表現(xiàn)出第3種癥狀的樣品有2個，第4種癥狀的樣品1個，均未檢出帶毒；表現(xiàn)其他類型癥狀的樣品有19個，其中2個（10.5%）檢出帶毒；與典型病株同叢的健株樣品13個，均沒有檢出病毒。

2.3 病害分級

如表2所示，在明確有無病害癥狀的基礎上，采用株高和結實情況2個指標，可以很好地區(qū)分病害的不同危害程度。0級：沒有任何病害癥狀，株高及結實正常，就屬于正常植株；1級：至少有1種類型的病害癥狀，株高及結實情況約為正常植株的4/5；2級：有1種類型以上的病害癥狀，株高及結實情況約為正常植株的3/4；3級：有多種類型的病害癥狀，株高及結實情況約為正常植株的2/3；4級：有1種類型以上的病害癥狀，株高及結實情況不到正常植株的1/3。2011～2012年再次對病害的分級標準進行了驗證，結果證明該病害分級能較好地符合病害實際發(fā)生危害的情況。

表2 南方水稻黑條矮縮病不同病級植株考查結果

3 討論與結論

雖然湖南省每年褐飛虱都有大發(fā)生，2011年晚稻也危害嚴重[5]，但所檢測樣品都沒有檢測到齒葉矮縮病毒，這可能是由于遷飛遲、帶毒率低等緣故。灰飛虱每年都有發(fā)生，且發(fā)生早，但對中晚稻的危害不重，故所檢測的樣品中也沒有檢測到普通水稻黑條矮縮病毒。白背飛虱在湖南省每年都有發(fā)生且與中晚稻秧田期和營養(yǎng)生長期吻合，故由白背飛虱傳播的南方水稻黑條矮縮病毒的檢出率較高，可能與當?shù)啬戏剿竞诎s病毒的其他寄主植物較為豐富有關。

研究結果表明，南方水稻黑條矮縮病毒樣品檢出率占全部檢測樣品的比例為19.44%，占有病害癥狀樣品的比例為23.73%，均屬較低水平，與當年大面積發(fā)病情況較輕是一致的。莖稈有蠟淚癥狀的樣品（第1、2種類型）病毒檢出率較高，因此可以把樣品是否具有蠟淚，作為判斷南方水稻黑條矮縮病的一個典型癥狀。其他類型的樣品雖然沒有蠟淚，但能檢測出病毒，其原因可能是因為病毒侵染較晚，癥狀表現(xiàn)（如蠟淚）還不充分，所以也不能忽視。而第3、4種類型樣品，由于不具有蠟淚這個典型癥狀，沒有檢測出病毒，所以可以認為不是由南方水稻黑條矮縮病毒引起的。建議在對病害進行分級調查時，采用0～4級的分級標準。

[1]陳聲祥，張巧艷.我國水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病研究進展[J].植物保護學報，2005，32（1）:97-103.

[2]徐志德.水稻黑條矮縮病在湖南普遍發(fā)生[J].湖南農(nóng)業(yè)科學，2009，（10）:141.

[3]劉見平，徐志德，劉都才，等.湖南省南方水稻黑條矮縮病發(fā)病調查及其原因分析[J].雜交水稻，2012，27（4）：72-75.

[4]張松柏，張德詠，劉 勇，等.2009年造成湖南省水稻大面積矮縮的是南方水稻黑條矮縮病[J].植物保護，2010，36（4）:98-100.

[5]周國輝，張曙光，鄒壽發(fā)，等.水稻新病害南方水稻黑條矮縮病發(fā)生特點及危害趨勢分析[J].植物保護，2010，36（2）：144-146.