光滑河藍(lán)蛤3個(gè)野生群體線粒體COI基因遺傳多樣性研究

孫 超，劉志鴻，楊愛國(guó)，周麗青，吳 彪，嚴(yán)加坤，侯 丫，董春光

（1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

光滑河藍(lán)蛤（Potamocorbula laevis），俗稱藍(lán)蛤，隸屬于抱蛤科（Corbulidae）河藍(lán)蛤?qū)伲╬otamocorbula），系廣溫性底棲貝類，常棲息于江河口附近水域的軟泥底質(zhì)海底，在我國(guó)南北方均有分布。光滑河藍(lán)蛤是蝦蟹的可口餌料，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，人們?cè)诠饣铀{(lán)蛤棲息地大規(guī)模捕撈，使光滑河藍(lán)蛤種質(zhì)資源遭受了極大破壞，亟需對(duì)光滑河藍(lán)蛤的種質(zhì)資源現(xiàn)狀進(jìn)行研究與保護(hù)。

線粒體DNA 是環(huán)狀分子，長(zhǎng)度在14～17 kb 之間[1]，具有進(jìn)化速度快、核苷酸替代率高[2]等特點(diǎn)，成為種類鑒別、群體遺傳學(xué)等研究的有效遺傳標(biāo)記[3]。線粒體DNA 基因序列的差異在遺傳多樣性研究中占有非常重要的地位[4-5]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)光滑河藍(lán)蛤的相關(guān)研究資料較少，在分子方面研究尚未見有報(bào)道。對(duì)3 個(gè)地理群體的光滑河藍(lán)蛤的線粒體細(xì)胞色素氧化酶（COI）基因片段進(jìn)行了測(cè)序分析，以期為光滑河藍(lán)蛤的種質(zhì)資源保護(hù)和種群遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

光滑河藍(lán)蛤3 個(gè)群體樣本分別于2012年采自東營(yíng)，濰坊，日照相關(guān)海域，每個(gè)地理群體光滑河藍(lán)蛤取樣品數(shù)為10，保存于-80℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用常規(guī)方法抽提DNA，取約20 mg 光滑河藍(lán)蛤肌肉組織，加入400 μL TEN 細(xì)胞裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值9.0；100 mmol/L EDTA；200 mmol/L NaCl），剪碎后再加入40 μL SDS（10%）和8 μL 蛋白酶K（10 mg/mL），于56℃水浴鍋內(nèi)消化，直到溶液澄清，用酚、氯仿抽提，異戊醇沉淀，然后用去離子超純水溶解。提取的基因組DNA 定量后配成20 ng/μL 的工作溶液備用。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增與電泳檢測(cè) 所用COI 基因引物序列為AR：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATT GG-3′；BR：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAA ATCA-3′，由上海生工合成。PCR 反應(yīng)在Eppendorf擴(kuò)增儀上進(jìn)行，30 μL 反應(yīng)體系：3 μL PCR 10×buffer （Mg2+plus），4 μL 2 mmol/L dNTP ，2 μL 10 μmol/L 的AR 與BR 引物，0.5 μL 5 U/μL Taq 酶，2 μL 20 ng/μL DNA，其余為純水。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)多次重復(fù)，PCR 結(jié)束后取樣用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（1×TBE，5V/cm 恒壓），利用凝膠成像系統(tǒng)（UVP，Biolmaging Systems）進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.3 測(cè)序和數(shù)據(jù)處理 PCR 產(chǎn)物由北京華大基因測(cè)序，將測(cè)序得到的序列用MegAlign 軟件分析其同源性和相對(duì)遺傳距離。并用MegAlign 軟件對(duì)所獲得的線粒體COI 基因片段序列進(jìn)行序列比較。用DnaSp4.0 軟件計(jì)算群體的單倍體型數(shù)（H）、平均核苷酸差異（K）及核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）。用MEGA5.0 軟件計(jì)算序列的堿基組成、變異位點(diǎn)以及遺傳距離，用NJ 法和UPGMA 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各結(jié)點(diǎn)的支持率以序列數(shù)據(jù)集1 000 次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值（Boot-Strap value）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體COI 基因片段序列分析

測(cè)序得到的目的片段經(jīng)過clustal W 比對(duì)后，去除引物及測(cè)序起始的部分序列，并經(jīng)過在線BLAST 分析，確認(rèn)得到665 bp 的COI 基因序列。利用MEGA 軟件計(jì)算這段序列的堿基組成（表1），3 個(gè)群體堿基組成基本一致，COI 基因序列T、C、A、G 和A+T 的平均含量分別為46.2%、13.3%、21.7%、18.8%及67.9%，A+T 含量顯著高于G+C 含量，這與線粒體DNA 堿基組成特點(diǎn)是相符的。

表1 光滑河藍(lán)蛤COI 基因片段的堿基組成

對(duì)這3 個(gè)不同地理群體的30 個(gè)光滑河藍(lán)蛤的COI 基因片段進(jìn)行分析，檢測(cè)到31 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，32 個(gè)變異位點(diǎn)，其中包括19 個(gè)單一變異位點(diǎn)和13個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。轉(zhuǎn)換位點(diǎn)3 個(gè)，顛換位點(diǎn)1 個(gè)，7個(gè)插入/缺失位點(diǎn)。堿基轉(zhuǎn)換與顛換的平均比值R=2.77。共檢測(cè)到18 種單倍體型，3 個(gè)群體有一個(gè)共用單倍體型，東營(yíng)群體和日照群體有2 個(gè)共用單倍體型，濰坊群體和日照群體有1 個(gè)共用單倍體型，其余單倍體型均為每個(gè)群體獨(dú)有，單倍體型及其在3 個(gè)群體中的分布如表2 所示。

表2 COI 基因單倍體型片段序列及變異位點(diǎn)

2.2 光滑河藍(lán)蛤群體多樣性分析

利用DNAsp4.0 計(jì)算群體內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果如表3 所示。3 個(gè)群體的COI 基因片段核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）為0.006 01，單倍體多態(tài)性（Hd）為0.890。由基于COI 基因片段可以看出，東營(yíng)群體核苷酸多樣性指數(shù)最高，為0.007 36，東營(yíng)群體單倍體多態(tài)性最高，為0.934，濰坊群體核苷酸多樣性指數(shù)最低，為0.004 46，濰坊群體的單倍體多態(tài)性最低，為0.867。

表3 光滑河藍(lán)蛤COI 遺傳多樣性參數(shù)比較

對(duì)群體間的遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，如表4所示，群體間COI 的平均核苷酸差異數(shù)（K）在3.450～4.380 之間，最低值3.450 出現(xiàn)在濰坊與日照群體之間，而最高值則出現(xiàn)在東營(yíng)與日照群體之間。根據(jù)群體間的平均遺傳距離（D），東營(yíng)群體和日照群體之間的平均遺傳距離最大，濰坊群體和日照群體之間的平均遺傳距離最小，在3 個(gè)群體中日照群體的核苷酸差異數(shù)最高。

表4 光滑河藍(lán)蛤群體間平均核苷酸差異數(shù)（K）和平均遺傳距離（D）

基因流（Nm）及遺傳分化系數(shù)（Fst）如表5 所示，數(shù)據(jù)顯示遺傳分化系數(shù)最高出現(xiàn)在東營(yíng)與濰坊群體之間，基因流最大出現(xiàn)在日照與濰坊群體之間，但是基因流小于1，說明兩個(gè)群體之間雖然有基因交流但是非常少。如表6 所示，群體間平均每位點(diǎn)核苷酸代替數(shù)（Dxy）最大出現(xiàn)在東營(yíng)群體和日照群體之間，群體間每位點(diǎn)凈核苷酸代替數(shù)（Da）最小值出現(xiàn)在東營(yíng)群體和日照群體之間，且為負(fù)值，說明東營(yíng)群體遺傳背景在3 個(gè)群體中較豐富，群體間的分化很少。

表5 基因流（Nm）和遺傳分化系數(shù)（Fst）

表6 光滑河藍(lán)蛤群體間遺傳差異比較

構(gòu)建基于COI 基因片段的系統(tǒng)發(fā)生NJ 樹（圖1）和UPGMA 樹（圖2），2 種進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，顯示出3 個(gè)群體之間的個(gè)體聚合在一起，沒有出現(xiàn)群體內(nèi)個(gè)體首先聚在一起的情況。

圖1 3 個(gè)群體光滑河藍(lán)蛤線粒體COI 基因片段的NJ 樹

圖2 3 個(gè)群體光滑河藍(lán)蛤線粒體COI 基因片段的UPGMA 樹

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞色素氧化酶（COI）基因進(jìn)化速度快，是分析和檢測(cè)群體遺傳變異的一種有效的分子標(biāo)記，在魚類[6]、蝦蟹類等[7-9]動(dòng)物中都有應(yīng)用。該研究對(duì)3個(gè)群體光滑河藍(lán)蛤COI 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增測(cè)序，得到665 bp 目的片段，A+T 含量明顯高于G+C 含量，這與牛東紅[10]、劉亞軍[11]、蘇天鳳[12]等研究中的A＋T 含量高于G＋C 含量的結(jié)果一致。COI 基因30條序列中共檢測(cè)到變異位點(diǎn)32 個(gè)，構(gòu)成18 種單倍體型，單倍體型多態(tài)性為0.890，低于牛東紅等[10]所研究的浙閩沿海海縊蟶（0.098 6）。基于COI 基因部分片段分析，3 個(gè)群體中有1 個(gè)共有單倍體型，除此以外，東營(yíng)群體與日照群體有2 個(gè)共用單倍體型，濰坊群體和日照群體有1 個(gè)共用單倍體型，其他單倍體型均為每個(gè)群體所獨(dú)有，這說明3 個(gè)群體都有各自的遺傳優(yōu)勢(shì)。COI 基因核苷酸多樣性指數(shù)東營(yíng)群體最高，為0.007 36，日照群體的核苷酸多樣性指數(shù)為0.006 45，這2 個(gè)群體的核苷酸多樣性指數(shù)均低于縊蟶0.008 7[10]，高于長(zhǎng)蛸0.005 72[13]，濰坊群體的核苷酸多樣性指數(shù)最低，為0.004 46。東營(yíng)群體核苷酸多樣性指數(shù)較高，這可能是由于其樣品采于自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，光滑河藍(lán)蛤棲息地人為保護(hù)較好，沒有遭到人為破壞，種群發(fā)展比較穩(wěn)定，積累的變異較多。濰坊群體取樣地點(diǎn)有捕撈船在當(dāng)?shù)卮罅坎刹豆饣铀{(lán)蛤，種群在一定程度上遭到了破壞，沒有足夠時(shí)間積累核苷酸變異，因此核苷酸多樣性指數(shù)較低，野生光滑河藍(lán)蛤資源數(shù)量減少，遺傳多樣性水平降低。

Fst 值可以表示群體間的遺傳分化程度，F(xiàn)st 值在0～0.05 之間，表示分化較弱，在0.25 以上表示遺傳分化極大。該研究中3 個(gè)群體之間的遺傳分化較弱。通過2 種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是一致的，不同群體的個(gè)體聚在一起，沒有出現(xiàn)明顯的同一群體首先聚類的情況。從地理位置上來看，東營(yíng)和濰坊地理距離較近，而這2 個(gè)群體之間的基因流卻最小，遺傳分化最大。濰坊群體和日照群體之間的基因流最大，遺傳分化最小，分析其原因，可能是東營(yíng)群體和濰坊群體雖然地理距離相對(duì)較近，但是都生活在封閉性較強(qiáng)的渤海，海水流動(dòng)緩慢導(dǎo)致基因交流很少，從而產(chǎn)生了相對(duì)較大的遺傳分化。日照地區(qū)蝦蟹養(yǎng)殖比較多，做為蝦蟹可口餌料的光滑河藍(lán)蛤在濰坊海域被大量捕撈后運(yùn)到日照地區(qū)，造成了一定程度上小范圍內(nèi)的基因交流，因此濰坊群體和日照群體之間的遺傳分化比東營(yíng)地區(qū)的遺傳分化要小。孟學(xué)平等[14]在研究西施舌5 個(gè)地理群體間遺傳分化也遇到了類似問題，廣西北海群體與黃海的3 個(gè)群體遺傳分化很弱，這也說明地理位置不是決定遺傳分化程度的決定性因素。

研究中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)群體的光滑河藍(lán)蛤存在一定的遺傳差異，但群體遺傳多樣性較小。因此，要提高檢測(cè)的遺傳多樣性的水平，應(yīng)再選擇核DNA 和線粒體DNA 其他的基因區(qū)域，如16S rRNA、COⅡ等基因得到多組序列數(shù)據(jù)等，從而更全面地分析光滑河藍(lán)蛤群體遺傳水平。

[1]Wolstenholme D R.Animal mitochondrial DNA：structure and evolution[J].Interernational Review of Cytology，1992，141：173-216.

[2]Whitmoer D H，Thaith，Craftcm.The largemouth bass ctyochrome bgene[J].Fish Bio，1994，44（4）：637-645.

[3]Hallerman E M.Population genetics：principle and applications for fisheries scientist[M].Bethesda，MD：American Fisheries Society，2003.

[4]Kappner I，BielerR.Phylogeny of venus clams（Bivalvia：Venerinae）as inferred from nuclear and mitochondrial gene sequences[J].Molecular Phylogenetics and Evolution，2006，40：317-331.

[5]Cannas R，Caul A，Deianal A M，et al.Discrimination between the Mediterranean spiny lobsters Palinuruselephasand P.mauritanicus（Crustacea：Decapoda）by mitochondrial sequence analysis[J].Hydrobiologia，2006，557：1-4.

[6]張鳳英，馬凌波，施兆鴻，等.3 種鯧屬魚類線粒體COI 基因序列變異及系統(tǒng)進(jìn)化[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（3）：392-399.

[7]楊學(xué)明，郭亞芬，蔣欽楊，等.三個(gè)群體羅氏沼蝦線粒體COI 基因的遺傳多樣性分析[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，15（2）：144-149.

[8]林 琪，李少菁，黎中寶，等.中國(guó)東南沿海青蟹屬不同種類的mtDNA COI 基因序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，47（2）：268-273.

[9]程漢良，夏德全，吳婷婷等，6 種簾蛤科貝類及4 種地理種群文蛤線粒體COI 基因片段序列分析[J].海洋學(xué)報(bào)，2007，29（5）：109-116.

[10]牛東紅，李家樂，汪桂玲，等.縊蟶六群體16S rRNA 基因片段序列的差異分析[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，（1）：1-6.

[11]劉亞軍，喻子牛，姜艷艷，等.櫛孔扇貝16SrRNA 基因片段序列的多態(tài)性研究[J].海洋與湖沼，2002，33（5）：477-483.

[12]蘇天鳳，黃建華，吳進(jìn)鋒，等.兩種東風(fēng)螺線粒體基因序列多態(tài)性研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2007，14（3）：369-376.

[13]孫寶超，楊建敏，孫國(guó)華，等.中國(guó)沿海長(zhǎng)蛸（Octopus variabilis）自然群體線粒體COI 基因遺傳多樣性研究[J].海洋與湖沼，2010，2（41）：259-265.

[14]孟學(xué)平，高如承，申 欣，等.西施舌5 個(gè)地理群體ITS1 序列變異及系統(tǒng)發(fā)生分析[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30（20）：5556-5561.