全球B型流感病毒耐藥相關突變株NA和HA序列特征分析

邢曉會，趙 翔，李希妍，成艷輝，譚敏菊，郭俊峰，黃維娟，隗合江，曾曉旭，王大燕，舒躍龍

近年來，全球每年都有B型流感病毒流行，并在部分地區引起小規模暴發，且有研究表明B型流感也能導致嚴重的疾病負擔［1－2］。B型流感病毒有兩種表面糖蛋白：血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase，NA）。HA的功能是識別并結合靶細胞表面的唾液酸受體，NA的功能是催化裂解唾液酸使子代病毒釋放并防止病毒形成聚集體，在這兩種蛋白貌似相反的功能機制下病毒得以入侵細胞并隨后釋放子代病毒，HA和NA在功能上相互影響，并會發生協同突變，以利于病毒的復制和傳播［3］。

NA抑制劑是目前上市的唯一對B型流感病毒有效的一類藥物，包括奧斯他韋，扎那米韋等，而B型流感病毒NA基因的變異會導致毒株對該類藥物的敏感性下降。隨著各國耐藥性監測體系的建立和完善，到目前為止，全球已經積累了相當的耐藥相關突變株信息，因此有必要探究B型流感病毒耐藥相關突變株的特點和規律，以獲得科學依據，提高流感防控能力。

1 材料與方法

1．1 毒株 中國國家流感中心采用血凝抑制實驗對?。屑壖部刂行淖?008年1月至2012年12月寄送的B型流感病毒進行復核鑒定，若為陽性，則選取部分毒株進行序列測定。血凝抑制實驗方法參見參考文獻［4］。

1．2 病毒RNA提取 使用德國QIAGEN公司Rneasy?Mini Kit，在QIACUBE全自動工作站提取病毒 RNA，100μL Rnase Free Water溶解后于－70℃保存備用。操作按試劑盒和儀器使用手冊進行。

1．3 一步法逆轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR） 采用德國 QIAGEN 公司的one－step RT－PCR Kit，按使用手冊進行操作。反應體系共25μL：Rnase Free Water 16μL，5×buffer 5μL，10mmol／L dNTP 1 μL，RNAsin 0．13μL，Enzymix 1μL，上下游引物各0．5μL，RNA模板1μL。反應條件：逆轉錄60℃l min，42℃20min，50℃20min，95℃15min，PCR擴增94℃30s，55℃30s，72℃1min，循環35次后，72℃10min。使用美國Affymetrix公司的USB?HT ExoSAP－IT?High－Throughput PCR Product Cleanup對PCR產物進行純化后，用于下一步測序反應。

1．4 測序 使用美國ABI公司的BigDye?Terminator v3．1Kit。反應體系共 10μL：Rnase Free Water 5．5μL，5×Sequencing Buffer 1．5μL，引物1μL，RR－2500 1μL，PCR純化產物1μL。測序反應條件為先96℃1min，然后循環擴增：96℃10 s，50℃5s，60℃4min，循環25次。使用ABI公司的BigDye?XTerminatorTM Purification Kit即SAMTMSolution對測序反應產物進行磁珠純化，然后在ABI公司的3730xl全自動DNA測序儀讀取序列。

1．5 序列分析和進化樹分析 利用Lasergene 7．1中的SeqMan軟件對DNA測序儀測得的序列進行拼接。此外，從 NCBI的Influenza Virus Database下載所需B型流感病毒的HA和NA基因序列。將我國2008－2012年測得的B型流感病毒序列、全球其他國家的B型耐藥相關突變株、近期疫苗株以及國內國際同期流行株的NA核苷酸序列和對應的HA核苷酸序列分別利用MEGA5．0軟件進行序列比對和分析，找出所有NA耐藥相關突變位點，并通過與同期敏感株相比，找出伴隨這些NA耐藥相關突變的其它NA突變和HA突變。進一步利用MEGA5．0軟件，采用鄰位相鄰法（Neighbor－Joining）分別構建HA和NA基因進化樹，設置bootstrap值為2000。

1．6 突變位點在蛋白質分子模型中的標記 在蛋白質數據庫（Protein Data Bank，PDB）中下載已有的B／Perth／211／2001病毒的NA蛋白晶體結構模型（PDB ID：3K36）和 B／Brisbane／60／2008病毒的HA蛋白晶體結構模型（PDB ID：4FQM），在此基礎上獲得B型流感病毒的NA單體和HA單體晶體結構模型，利用RasWin軟件展示和標記耐藥相關突變位點和伴隨突變位點。

2 結 果

2．1 NA耐藥相關突變位點與伴隨突變位點 通過序列分析，在我國2008－2012年682株B型流感病毒中，共發現6株B型流感病毒的NA基因攜帶耐藥相關突變。全球其他地區發現的B型耐藥相關突變株共有22株，其中有4株病毒的NA突變僅為文獻報道，但在NCBI中未收錄其NA基因序列，本文未做分析。故本文共分析了24株病毒的NA序列和其相應的HA序列，NA耐藥相關突變以及伴隨的NA其它突變和HA突變位點信息總結于表1。由表1可知，我國2008年沒有發現耐藥相關突變株；2009年發現1株，攜帶H273Y突變；2010年發現3株，均攜帶I221T突變；2011年發現2株，分別攜帶I221T突變和D197N突變；2012年我國所有B型流感病毒的NA均未發生與耐藥相關的位點突變。上述6株病毒中除攜帶H273Y突變的毒株屬于B－Victoria系之外，其他5株病毒均屬于B－Yamagata系。

表1 B型流感病毒NA耐藥相關突變位點以及NA、HA伴隨突變位點Tab．1 Mutations associated with drug resistance in NA and the secondary mutations in NA or HA gene of influenza B virus

全球其他地區的耐藥相關突變株最早發現于1987年，而2010－2011年發現的耐藥相關突變株最多，2012年沒有發現。這些突變株大多攜帶I221V／T、D197N、H273Y和E117G／A等常見位點突變，也有少量毒株攜帶 A245T／S、T325I和R374K等罕見位點突變。上述24株耐藥相關突變株中有13株屬于B－Victoria系、11株屬于BYamagata系。

在我國重慶和上海發現的、攜帶NA I221T突變的4株B－Yamagata毒株，只有1株（即B／Shanghai－Pudongxi／1125／201）攜 帶 HA S208P 伴 隨 突變，其他3株不攜帶任何NA或HA伴隨突變；而在美國北卡羅來納州聚集性病例中發現的、攜帶NA I221V突變的3株B－Victoria病毒株均伴隨NA T8M、NA S397R和 HA V15I突變，其中有1株（即B／North Carolina／13／2010）還伴隨 NA K360E 突變，或許正是由于這些伴隨突變的存在才使得這些攜帶NA I221V突變的B型病毒當時能夠在社區中引起暴發流行。

攜帶NA D197N突變的B－Yamagata系毒株B／Beijing－Xicheng／11496／2011攜帶 NA T437I伴隨突變；同樣發生NA D197N突變的B／Rochester／02／2001病毒則攜帶 NA K418N 和 HA D／E164G伴隨突變。發生NA H273Y突變的B－Victoria系毒株B／HunanLousong／1826／2009不攜帶任何 NA或HA伴隨突變，美國H273Y突變株B／Michigan／20／2005也為B－Victoria系，則攜帶2個 HA伴隨突 變 S10A、V190I，而 加 拿 大 B－Yamagata 系H273Y 突變株 B／Ontario／006876／2011攜帶4個NA伴隨突變T46P、L153M、E288G、L455M。

總體而言，我國2008－2012年發現的6株耐藥相關突變株攜帶的伴隨突變位點較少（僅有2個），而國外發現的耐藥相關突變株攜帶的伴隨突變較多，并且我國的耐藥相關突變株攜帶的耐藥相關突變大多相同，但伴隨突變均不相同，提示這些伴隨突變是隨機發生的，也可能與地域差異有關。

2．2 NA和HA基因序列進化分析 為分析耐藥相關突變株NA和HA基因的進化特征，利用MEGA5．0軟件對全球（包括我國）所有B型耐藥相關突變株、近期疫苗株以及國內外同期未發生耐藥相關突變的流行株序列構建進化樹，共計包括101株病毒的NA核苷酸序列和相應的HA核苷酸序列，結果如圖1和圖2所示，可見我國的耐藥相關突變株大多屬于B－Yamagata系，國外的大多屬于BVictoria系?？傮w而言，我國耐藥相關突變株的NA、HA序列與國外的NA、HA序列處于不同的進化分支。

圖1 B型流感病毒的NA耐藥相關突變位點及其NA、HA伴隨突變位點Fig．1 Mutations associated with drug resistance in NA and the secondary mutations in NA or HA of influenza B virusThe mutations associated with drug resistance in NA were showed in purple font and the secondary mutations in NA or HA in black font．Mutations associated with drug resistance were showed in the same color with the corresponding secondary mutations．A：The crystal structure of NA；B：The crystal structure of HA．

2．3 耐藥相關突變株的NA和HA蛋白晶體結構特點 利用RasWin軟件分別展示耐藥相關突變株NA和HA蛋白的表面和內部位點。圖3為利用RasWin軟件標記的B型流感病毒NA耐藥相關突變以及NA、HA伴隨突變，由該圖可以看出，有些突變位點位于NA酶活性中心或HA受體結合部位，也有些位于NA、HA的結構框架位點（framework）上，還有個別突變位于NA、HA的非功能區和非結構區。在整個空間構型上，有些耐藥相關突變位點與其伴隨突變位點相距較遠，有些則相距較近。

圖2 B型流感病毒耐藥相關突變株NA基因進化分析Fig．2 Phylogenetic analysis of NA gene of influenza B viruses associated with drug resistanceBlack circle－－Strains associated with drug resistance isolated from China；Black triangle－－Strains associated with drug resistance isolated from other countries in the world；Black square－－Recent vaccine candidate strains．

3 討 論

B型流感病毒的兩種表面糖蛋白HA和NA，是影響流感病毒在體內生存的重要因素，并且其功能相互影響。Fumihiro［5］等的研究表明，發生 HA E190K突變的A（H1N1）病毒在表達NA的MDCK細胞（即NA－MDCK）中的生長情況優于其在不表達NA的MDCK細胞（即正常MDCK細胞）中的生長情況，體現了HA和NA在功能上的協同補償機制。

圖3 B型流感病毒耐藥相關突變株HA基因進化分析Fig．3 Phylogenetic analysis of HA gene of influenza B viruses associated with drug resistanceBlack circle－Strains associated with drug resistance isolated from China；Black triangle－Strains associated with drug resistance isolated from other countries in the world；Black square－Recent vaccine candidate strains．

NA耐藥相關突變均位于NA的酶活性功能區或結構區，這些突變的產生，會導致NA的功能受到影響，可能會降低病毒的復制和傳播能力。NA耐藥相關突變對病毒適應性和傳播力造成的影響可依下述因素不同而不同［6］：突變位置（催化位點或者結構位點），NA型別／亞型，毒株的遺傳背景，NA補償突變的存在，NA功能的損失程度，以及適當的HA－NA功能平衡。另外，宿主免疫反應的不同以及遺傳背景的差異也會對其產生影響。既往有研究表明，攜帶NA R150K耐藥相關突變的B型流感病毒在雪貂中的感染性和傳播性有所降低［7］，而與此相反，攜帶NA D197N突變的B型流感病毒在雪貂中的生長特性與野生型相似［8］，這些差異，可能是伴隨突變的影響造成的。伴隨突變對NA耐藥相關突變株的毒株特性的影響，在A型流感病毒的相關研究較多，Jesse［9］等和 Teridah［10］等分別指出，A 型流感病毒NA發生的部分突變（如：R194G，R222Q，V234M等）以及HA發生的部分突變（如：T82K，K141E，R189K等）可對耐藥相關NA突變起到一定的補償作用，因此我們推測B型流感病毒也存在耐藥相關突變位點之外的起補償作用的位點，因此，我們對全球B型流感病毒耐藥相關突變株的序列特點進行了分析，并發現了多個位于NA和HA基因的伴隨突變位點。本文發現的伴隨突變位點為進一步通過反向遺傳學的方法驗證這些位點對B型流感病毒的適應性和傳播力的補償功能打下了基礎。

2011年初，美國從北卡羅來納州的聚集性病例中，分離到14株對奧司他韋和帕拉米韋敏感性降低的B型流感病毒［11］。這提示我們，出現生物學適應性未降低的流感病毒耐藥株是很有可能的，況且目前發現的耐藥相關突變株其突變位點多種多樣，因此應進一步在全球范圍內加強對流感病毒的耐藥性監測，及時發現新的耐藥相關突變株，并做好流感大流行出現耐藥株的應對措施。我們的研究表明，我國的B型流感病毒耐藥情況與國際情況并不十分一致，故應更加密切監測我國流感病毒的耐藥情況，這對于我國流感防控策略的制定和臨床用藥具有現實指導意義。

［1］Paul Glezen W，Schmier JK，Kuehn CM，etal．The burden of influenza B：a structured literature review［J］．Am J Public Health，2013，103（3）：e43－51．DOI：10．2105／AJPH．2012．301137

［2］Feng L，Shay DK，Jiang Y，etal．Influenza－associated mortality in temperate and subtropical Chinese cities，2003－2008［J］．Bull World Health Organ，2012，90（4）：279－288．DOI：10．2471／BLT．11．096958

［3］Myers JL，Hensley SE．Oseltamivir－resistant influenza viruses get by with a little help from permissive mutations［J］．Expert Rev Anti Infect Ther，2011，9（4）：385－388．DOI：10．1586／eri．11．2

［4］Kendal AP，Pereia MS，Shekel J．Concepts and procedures for laboratory－based influenza surveillance［M］．Geneva： World Health Organization，1982．

［5］Gen F，Yamada S，Kato K，etal．Attenuation of an influenza A virus due to alteration of its hemagglutinin－neuraminidase functional balance in mice［J］．Arch Virol，2013，158（5）：1003－1011．DOI：10．1007／s00705－012－1577－3

［6］Govorkova EA．Consequences of resistance：in vitro fitness，in vivoinfectivity，and transmissibility of oseltamivir－resistant influenza A viruses［J］．Influenza Other Respi Viruses，2013，Suppl 1：50－57．DOI：10．1111／irv．12044

［7］Gubareva LV，Matrosovich MN，Brenner MK，etal．Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus［J］．J Infect Dis，1998，178（5）：1257－1262．

［8］Mishin VP，Hayden FG，Gubareva LV．Susceptibilities of antiviral－resistant influenza viruses to novel neuraminidase inhibitors［J］．Antimicrob Agents Chemother，2005，49（11）：4515－4520．

［9］Bloom JD，Gong LI，Baltimore D．Permissive secondary mutations enable the evolution of influenza oseltamivir resistance［J］．Science，2010，328（5983）：1272－1275．DOI：10．1126／science．1187816

［10］Ginting TE，Shinya K，Kyan Y，etal．Amino acid changes in hemagglutinin contribute to the replication of oseltamivir－resistant H1N1influenza viruses［J］．J Virol，2012，86（1）：121－127．DOI：10．1128／JVI．06085－11

［11］Sleeman K，Sheu TG，Moore Z，etal．Influenza B viruses with mutation in the neuraminidase active site，North Carolina，USA，2010－11［J］．Emerg Infect Dis，2011，17（11）：2043－2046．DOI：10．3201／eid1711．110787