3種中藥注射液突變選擇窗的測定

李 虹，葉 云，王國俊△

（1.四川省樂山市人民醫院藥劑科 614000；2.瀘州醫學院附屬醫院藥劑科，四川瀘州 646000）

近年來，細菌耐藥相關研究備受關注，1999年有研究小組提出防突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）理論［1］，MPC是指防止第一步耐藥突變株被選擇性富集擴增所需的最低抗菌藥物濃度。最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）與 MPC之間的濃度范圍定義為MSW。MSW相關理論認為：只有藥物濃度在野生型藥物敏感菌的 MIC和 MPC之間即在 MSW內時，耐藥突變菌株才被選擇性擴增。當藥物濃度低于MIC時，由于它可使整個病原菌群增強，沒有選擇壓力而不會導致耐藥突變菌株被選擇。當藥物濃度高于 MPC時，由于細菌必須同時產生兩種或兩種以上耐藥突變才能生長，因此也不會有耐藥突變菌株被選擇出來。這一理論為解決抗菌藥物的耐藥問題提供了新思路。關于 MPC和 MSW的研究，目前主要集中在氟諾酮（fluoorquinolone，FQ）類等西藥抗菌藥物對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、沙門菌、結核分支桿菌、非結核分支桿菌等的體外實驗研究［2-4］。雖然大量文獻報道中藥具有抑菌作用［5-7］，但相關研究主要集中在對中藥及其制劑的 MIC的測定［8］，對其 MPC、MSW的研究目前尚未見相關報道。

本文擬體外測定3種中藥注射液的MIC、MPC、MSW，探討中藥注射液抑制金黃色葡萄球菌耐藥突變菌株選擇能力，為中藥在抗感染性疾病方面的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 金黃色葡萄球菌ATCC29213，中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 培養基 營養肉湯培養基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號：100804）；MH瓊脂（杭州天和微生物試劑有限公司，批號：100804）。

1.1.3 藥物 大蒜素注射液 （徐州萊恩藥業有限公司，2mL：30mg，批號：1008261）；雙黃連粉針（哈藥集團中藥二廠，600 mg／支，批號：1003015）；喜炎平（江西青峰藥業有限公司，2 mL：50mg，批號：20101115）。

1.1.4 實驗儀器 CO2培養箱（HH.CP-01，上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 從新鮮過夜培養的細菌平板上挑取多個菌落接種于含10mL營養肉湯的試管中，并標記為管A，置于孵育箱中24h。24h后，拿出管A并采用活菌計數法對管A中金黃色葡萄球菌進行計數。將管A搖勻后，取20μL，經5次10倍稀釋后，取最后一個稀釋度的菌液20μL均勻的涂布在血平皿上，同法做4個平行對照。并標記為1、2、3、4。將4個血平皿放入37℃的培養箱中培養24h，長出菌落后，計數，并根據最后的平均結果推算出原菌液的含菌數。此時管A中金黃色葡萄球菌的數目約為2×1012CFU／mL。將已知菌落數的管A經一系列稀釋后，將菌液稀釋于試管中調整為6×105CFU／mL，并標記為管B，將管A、B置于4℃中冷藏保存。

1.2.2 MIC的測定 采用標準瓊脂2倍稀釋法，分別測定雙黃連粉針、喜炎平注射劑、大蒜素注射劑3種中藥注射液對金黃色葡萄球菌的MIC，每一濃度設6個平行對照。陰性對照組為未加藥物的培養基。陽性對照組按參考文獻進行配制（測定MIC的陽性對照組的藥物濃度為0.13μg／mL的左氧氟沙星）［9］。倍比遞增藥物濃度，配制含雙黃連粉針、喜炎平注射液、大蒜素注射液的幾個濃度梯度的MH瓊脂平板。取20μL管B中細菌均勻涂抹在各含藥平皿上，使MH瓊脂上接種菌量為1.2×104CFU，用L形棒均勻涂布，并繞壁2圈。每個濃度6個平皿，根據CLSI 2005年標準進行判讀結果。37℃培養24h后觀察結果，以平板上無菌生長的最低藥物濃度定為MIC。

1.2.3 MPC的測定 采用標準瓊脂2倍稀釋法分別測定雙黃連粉針、喜炎平注射劑、大蒜素注射劑3種中藥注射液對金黃色葡萄球菌的MPC，每一濃度設6個平行對照。陰性對照組為未加藥物的培養基。陽性對照組按參考文獻進行配制（測定MPC的陽性對照組的藥物濃度為1.3μg／mL左氧氟沙星）［9］。以MIC為基準，倍比遞增藥物濃度，制備幾個濃度梯度的含不同藥物濃度的MH瓊脂平皿。取20μL管A菌液均勻涂抹在各含藥平皿上，并繞壁2圈，每個藥物濃度用6個平皿，使每個藥物濃度平皿的細菌總接種量為1.2×1010CFU。并置于培養箱中37℃孵育，24、48、72h后觀察各平皿中金黃色葡萄球菌的生長情況，孵育72h后仍無細菌菌落生長的最低藥物濃度為暫定MPC（MPCpr），再以 MPC（MPCpr）為基準線性增減20%，重復MPCpr的測定步驟，每濃度作6個平皿，以平皿中不出現菌落生長的最低藥物濃度即為MPC。對接近MPC藥物濃度篩選出來菌株接種無藥物的瓊脂平板上，傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確保其是耐藥突變株。

1.2.3 MSW和SI的計算 藥物MIC和MPC之間的范圍即為MSW。藥物的MPC與MIC的比值（MPC／MIC）即為藥物選擇指數SI。

2 結 果

2.1 MIC的測定 結果表明：雙黃連粉針的MIC為1.905 mg／mL，喜炎平注射劑的 MIC＞1.000mg／mL，大蒜素注射劑的MIC為5.960×10-3mg／mL。見表1。

表1 3種中藥注射液對金黃色葡萄球菌的MIC（n=6）

2.2 MPC的測定 結果表明：雙黃連粉針MPC為14.737 mg／mL；喜炎平注射劑的 MPC＞15.385mg／mL；大蒜素注射劑MPC為3.850×10-2mg／mL。見表2。

表2 3種中藥注射液對金黃色葡萄球菌的MPC（n=6）

續表2 3種中藥注射液對金黃色葡萄球菌的MPC（n=6）

2.3 3種中藥注射液的MSW及SI 結果表明：雙黃連粉針和大蒜素注射劑的SI值相差不是特別大，并且兩種中藥制劑的SI都小于左氧氟沙星，從小到大依次為：大蒜素注射液小于雙黃連粉針小于左氧氟沙星。見表3。

表3 3種中藥注射液的MSW及SI

3 討 論

隨著加入的喜炎平注射液越多，瓊脂板變得越來越柔軟，在接種細菌時很容易使其破裂，所以未制作含更大濃度的喜炎平注射液的瓊脂平板進行MIC和MPC值的測定。本研究表明，大蒜素注射液、喜炎平注射液、雙黃連粉針對金黃色葡萄球菌ATCC29213均有不同作用的抑制作用，其抑菌能力為大蒜素注射液大于雙黃連粉針大于喜炎平注射液。李朝霞等［10］測定了6種不同抗菌藥物左氧氟沙星、阿奇霉素、利福平、萬古霉素、妥布霉素、氯霉素對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC、MPC和 MSW。它們的 MIC分別為0.125、1.0、0.002、0.5、3.0、0.5μg／mL；MPC分別為1.4、51.2、＞1 024、4.8、16、16 μg／mL。這6種抗菌藥物對金黃色葡萄球菌的MSW差異很大，以利福平的MSW最寬（SI＞512 000），氯霉素的 MSW最窄（SI=5.3）。比較而言，以上3種中藥制劑對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC值均明顯高于西藥抗菌藥物，表明其抗菌作用弱于西藥抗菌藥物，但雙黃連粉針及大蒜素注射液對金黃色葡萄球菌的選擇指數均較低，且明顯低于陽性對照組的左氧氟沙星，說明上述中藥制劑限制耐藥突變菌株選擇的能力較強，提示某些中藥在對抗細菌耐藥方面可能發揮其獨特的優勢。而大蒜素注射液的MIC及MPC值遠小于雙黃連的MIC及MPC值，提示大蒜素注射液對金黃色葡萄球菌的抑菌能力比較強。大蒜素較強的抑菌作用可能是因為其具有獨特的藥理活性——容易透過磷脂膜和紅細胞膜進入細胞內，從而與一些截留化合物相互作用，實現其藥理價值［11］。

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