豬場疫病實驗室檢驗的應用分析與建議：病原檢測

朱秀高

（武漢回盛生物科技有限公司，湖北武漢430042）

近年來隨著人們養(yǎng)豬規(guī)模的擴大及國外引種數量的增長，人們發(fā)現雖然我們的養(yǎng)殖硬件設施在不斷提高、養(yǎng)豬人員的經驗和學歷水平在不斷增加，但還是有一些新的疾病持續(xù)出現，如高致病性藍耳病、圓環(huán)病毒病，也有一些原來僅存在于課本中的疾病開始出現于我們的豬群中，并造成嚴重危害，如副豬嗜血桿菌病、傳染性萎縮性鼻炎和回腸炎，同時多種疾病導致的混合感染已經成為當前豬場中所面臨的主要威脅，如高熱病、仔豬原因不明性腹瀉和呼吸道疾病綜合征等。

眾所周知，在應對疾病時，特別是當豬群發(fā)生疾病時，正確的診斷應當是采取進一步措施的必要前提。在國內80年代之前的養(yǎng)殖環(huán)境中，有經驗的獸醫(yī)單憑對某幾個特殊臨床癥狀的觀察就能確診豬只所發(fā)疾病，并采取相應有效的治療措施，但隨著近年來混合感染的出現，單憑臨床觀察，甚至配合病理剖檢都不能再100%確診豬只所患疾病種類，因此為了提高診斷的準確性，為治療和預防措施的制定與實施提供參考，一些有條件豬場開始采取與科研單位合作或自己建立實驗室的方式，進行疾病的實驗室診斷，但我們在與豬場交流過程中發(fā)現，由于實驗室檢驗方式的專業(yè)性要求較高，因此除了一些超大規(guī)?；i場外，很多豬場在面對如何進行實驗室檢驗，特別是在如何解讀檢驗報告方面，欠缺很大，甚至由此造成很多不必要的誤會和對實驗室檢驗的不信任。為了使大家能夠對實驗室檢驗所用方法有一個清晰的認識，特別是能夠學會如何正確的閱讀與分析檢驗報告，本文主要集中于病原檢測即針對病原檢驗所用方法的討論與分析。

病原，顧名思義即導致發(fā)病的原因，針對于傳染病來說主要是指細菌、病毒等各類微生物，從檢測的項目來分，目前實驗室中針對微生物檢驗所用的方法可以劃分為直接法和間接法兩種，其中直接法中含有專門針對細菌的培養(yǎng)法和針對各類病原的PCR法，間接法主要是指野毒抗體檢測法。

1 直接法

直接法是指通過直接對微生物本體或其某一組分的檢驗，來達到測定樣品中某一特定微生物的有無及其含量的一類方法。

1.1 培養(yǎng)法

嚴格來說培養(yǎng)法中包含對細菌和病毒兩類病原體的培養(yǎng)，但一般豬場所能用到的培養(yǎng)僅有針對細菌的培養(yǎng)，因此本敘述中，以細菌培養(yǎng)為主要對象進行討論。

臨床上一個較為完備的細菌培養(yǎng)流程，需要配備以下幾種簡單設備：無菌操作臺、酒精燈、接種環(huán)、培養(yǎng)箱、顯微鏡、常規(guī)染色劑及培養(yǎng)板，其中培養(yǎng)板可以購買商業(yè)化培養(yǎng)皿或自己制作。

當懷疑發(fā)病豬只存在細菌感染時，需要根據經驗初步判斷培養(yǎng)所需的特殊培養(yǎng)皿或通用培養(yǎng)皿，并對培養(yǎng)條件進行準備。將病料組織接種于培養(yǎng)皿時，最好進行無菌操作，接種后的平皿應詳細編號記錄，并在培養(yǎng)過程中定期做好觀察，一般培養(yǎng)24小時（特殊細菌除外）即可見到有明顯的菌落長出，接下來的工作就是要通過對菌落形態(tài)和細菌染色后的鏡檢，判斷感染細菌的種類，如果有條件還可以進行如生化鑒定、攻毒實驗等方法來確定。

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行細菌鑒定時，經驗是實驗能夠成功及準確與否的關鍵因素，因為這一流程中的很多環(huán)節(jié)需要通過人的主觀意識來進行評判，如細菌的生長情況、菌落的特征、染色的操作和顯微鏡的檢查等。為了進一步提高細菌培養(yǎng)檢查的準確性與客觀性，同時提高操作的簡單性，目前已經開發(fā)出了一些細菌鑒定系統(tǒng)，這些系統(tǒng)主要是通過對細菌在培養(yǎng)過程中所表現出來各項特性的評分，來達到最終確認該細菌屬于哪種類別的目的。從應用來看，此類系統(tǒng)的準確性較高，且操作簡單。建議豬場如果有條件，在建立自己的實驗室時，還是應以購入此類系統(tǒng)為主。

1.2 PCR法

PCR法是分子生物學方法的一種，也是微生物分子生物學分析流程的關鍵環(huán)節(jié)，其理論依據是微生物分子核酸序列的專一性和特異性，根據測定對象及過程的區(qū)別可以分為普通PCR方法（針對DNA）和RT-PCR方法（針對RNA）兩類，能夠實現對細菌、病毒、支原體等各類微生物性病原的檢測。該方法操作相對簡單，但如果要進行結果解讀及問題分析則需要較深的理論知識。

臨床上該方法的應用，所需設備及試劑價格高昂，且對實驗條件和實驗人員要求較高。一般來說所需設備主要有PCR儀、電泳儀、紫外儀、超凈臺、冷凍離心機等，另外還需要建立專用的操作間，以防樣品交叉污染和對人體產生損害。試劑方面，由于自配試劑的不穩(wěn)定性，現在多傾向于使用商品化試劑盒，不過商品化試劑盒的批間差異性和品牌差異性，也給該方法的應用及結果間的比較帶來困難。人員方面，一般認為該方法能夠實現流程化操作，所需人員只需能熟練操作即可，其實不然，由于該方法環(huán)節(jié)眾多，且易出現假陽性、假陰性等情況，如果操作人員沒有一定的分子生物學背景，則很難對這些情況的出現給出合理解釋，并提出解決方案。所以如果豬場想要建立自己的PCR診斷實驗室，個人認為，首先就是要做好選人工作，其次才是各類設備的采購與制度建設。

2 間接法

間接法即測定的核心目的是檢查病原的有無，但由于沒有合適的直接法或直接法操作復雜，因此通過測定其他能夠反映病原的項目來判斷病原是否存在。最常見的間接法測定病原是各類野毒抗體檢測法，即通過對體內野毒抗體的測定來判斷動物機體是否存在野毒病原感染。如偽狂犬gE-ELISA抗體測定法和藍耳病野毒抗體測定法。

采用此類方法的關鍵是要有合適的基因缺失疫苗與相應的基因抗體檢測試劑盒，兩者缺一不可，目前僅有偽狂犬病、藍耳病及豬瘟（國內沒有）能夠實現用該方法檢測。由于每種試劑盒的檢測項目判斷標準不一，所以豬場在自己應用測定時，應于實驗前仔細閱讀其說明，并嚴格按照說明書要求操作與計算，以保證實驗結果的準確性。

前已述及，基于病原檢測的準確性診斷是采取進一步措施治療豬病的前提。豬場不管是與科研院所合作進行代檢，還是建立自己的專有實驗室，其中關鍵性的一環(huán)就是要選擇合適的方法，同時要對該方法有較為全面的了解，特別是對于自建實驗室來說，應以準確、操作方便、實用為主要考慮，而沒有必要一味的追求高精尖。