不同培肥模式對茶園土壤微生物活性和群落結構的影響

林新堅，林 斯，邱珊蓮，陳濟琛，王 飛，王利民

(1福建省農業科學院土壤肥料研究所，福建福州350003;2福州大學生物科學與工程學院，福建福州350108)

茶園紅壤廣泛分布在中國南部和部分中部熱帶亞熱帶地區，因其pH值低，淋洗作用強，有機質及養分流失嚴重［1］，加之土地的過度開發和不合理施肥等人為活動，造成土壤理化性質惡化，導致土壤肥力下降。但是，施肥能激活休眠細胞參與土壤物質循環［2］，是改善土壤理化性質，提高作物產量，改善茶葉品質的重要環節。近年來，人們對施肥與茶園土壤生態環境因子之間的響應做了大量的研究，徐華勤等［3－4］、鄧欣等［5］和林新堅等［6］分別報道了各地茶園土壤在不同培肥措施下對微生物群落功能、微生物碳、微生物數量和茶葉產量等的影響，闡明了施肥與土壤質量及茶樹生長狀況之間的內在聯系。但是，在紅黃壤區茶園，何種培肥模式更合理?以及其對土壤酶活性和微生物有何影響尚不清楚。因此，本文以閩東地區紅壤茶園長期定位實驗地為平臺，通過測定茶園土壤微生物生物量、微生物數量、酶活性和PLFAs定性分析，探討不同培肥處理對土壤微生物特征和酶活性的影響，闡明各指標與土壤質量及各指標間的相互關系。為紅壤區茶園高產高效、安全環保可持續發展培肥模式提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤 試驗設在福建省福安市市郊天香茶葉有限公司長期培肥定位區，位于福建省東北沿海(119°23'～119°51'E ，26°41'～27°24'N)，屬于中亞熱帶海洋性季風氣候。地貌以中、低山，丘陵為主，適宜茶樹生長。試驗區年均氣溫19.3℃，年日照時數1836.6 h，年降水量1539.9 mm，3～9月份為雨季，占年降水總量的81.5%，10月份至翌年2月份為旱季。

試驗區內的土壤母質為侵入巖和火山巖，地帶性土壤為紅黃壤。供試土壤基礎肥力:有機質含量7.40 g/kg、全氮0.40 g/kg、水解氮58.34 mg/kg、有效磷 0.87 mg/kg、速效鉀 77.20 mg/kg、pH值5.19。

1.1.2 供試肥料 有機肥為“農地樂牌”精制有機肥，其有機質含量368.90 g/kg、全氮9.00 g/kg、全磷(P2O5)22.90 g/kg、全鉀 (K2O)5.29 g/kg。化肥分別為尿素、磷酸一銨和氯化鉀，每年冬季進行條施。綠肥品種為圓葉決明(Cassia rotundifolia，34721品系)，播種量7.50 kg/hm2，每年冬季自然枯萎并覆蓋于茶園行間的表土上，種子成熟后隨之散落，次年春天萌芽。

1.1.3 供試茶樹 黃觀音(Camelliasinensis‘huangguanyin’)。

1.2 試驗設計

定位試驗始于2006年，設6個處理，3次重復，隨機區組排列，小區面積13.65 m2。6個處理分別為:1)CK，不施肥;2)NPK，全量化肥(年施 N 102.90 kg/hm2、P2O533.90 kg/hm2、K2O 33.90 kg/hm2);3)NPKO，半量化肥(年施 N 51.45 kg/hm2、P2O516.95 kg/hm2、K2O 16.95 kg/hm2)+半量有機肥(年施量5716.50 kg/hm2);4)O，全量有機肥(年施量11433.00 kg/hm2);5)NPKL，全量化肥(年施 N 102.90 kg/hm2、P2O533.90 kg/hm2、K2O 33.90 kg/hm2)+豆科綠肥;6)NPKOL，半量化肥(年施 N 51.45 kg/hm2、P2O516.95 kg/hm2、K2O 16.95 kg/hm2)+半量有機肥(有機肥年施量5716.50 kg/hm2)+豆科綠肥，且以后每年均按照此試驗設計連續進行。

1.3 樣品采集及處理

土樣采集時間為2011年5月，各試驗小區內按“S”形取樣，隨機布點采集茶園0—20 cm土層樣品，混勻，每處理3個重復。濕土去除石礫和植物殘根等雜物，過2 mm篩，測定理化性質;供土壤酶活性、微生物生物量和微生物數量分析的土樣貯于4℃冰箱;供PLFAs分析的土壤樣品在－70℃超低溫冰箱冷凍保存。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤化學指標測定 pH值用電位法，有機質用重鉻酸鉀氧化—外加熱法，全氮用半微量凱氏法，水解氮用堿解—擴散法，有效磷用 0.03 mol/L NH4F－0.025 mol/L HCl浸提法，速效鉀用1 mol/L乙酸銨浸提—火焰光度法［7］測定。

1.4.2 土壤可培養微生物測定 土壤可培養微生物采用平板分離計數法［8］;細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基分離培養;放線菌采用高氏1號培養基;真菌采用孟加拉紅培養基。

1.4.3 土壤微生物生物量碳、氮測定 將新鮮土壤樣品于25℃下密封預培養7～10 d，然后采用氯仿熏蒸—K2SO4提取法［9］提取土壤中微生物碳、氮:稱取預處理濕土20.0 g(烘干基重)于25 mL培養皿中，置于底部含少量NaOH、少量水(約200 mL)和去乙醇氯仿的真空干燥器中，將密封的真空干燥器抽真空至氯仿沸騰并保持3～5 min。而后將干燥器放入25℃培養箱中黑暗培養24h。將干燥器再次抽真空除盡土壤中吸附的氯仿，置于200 mL提取瓶中，加入50 mL 0.5 mol/L K2SO4提取液，在25℃下，300 r/min振蕩 30 min，再 3000 r/min離心 5 min，取上清液過濾。采用Shimadzu TOC 500測定儀自動測定提取液中的微生物量碳、氮。

1.4.4 土壤酶活性測定 過氧化氫酶參照Trasar-Cepeda［10］的方法測定; 轉化酶采用3，5－ 二硝基水楊酸 比 色 法［8］測 定; 脲 酶 采 用 Kandeler和Gerber［11］的 方 法 測 定; 酸 性 磷 酸 酶 按 照Tabatabai［12］方法測定。

1.4.5 土壤微生物PLFAs分析 磷脂脂肪酸的提取過程和分析參考 Frosteg?rd［13］和 Kourtev［14］方法:1)脂肪酸的釋放與甲酯化 取10 g土樣于50 mL離心管中，加入15 mL 0.2 mol/L的KOH甲醇溶液，斡旋震蕩5 min，并于37℃水浴溫浴1 h，每10 min斡旋樣品一次;2)中和溶液pH 加入3 mL 1.0 mol/L的醋酸溶液中和，充分搖勻;3)脂肪酸的萃取 加入10 mL正己烷，充分搖勻，800 r/min離心15 min，打開管蓋，上層正己烷于干凈玻璃試管中，氮氣吹干使溶劑揮發;4)轉移 在玻璃試管中加入0.5 mL體積比為1∶1的正己烷甲基丁基醚溶液，充分溶解3～5 min，轉入GC小瓶，同時加入10 μL濃度為1 g/L的內標物19∶0，并上機測定。

PLFAs的檢測采用美國MIDI公司生產的微生物自動鑒定系統(Sherlock Microbial Identification System Sherlock MIS4．5)進行，包括 Agilent 6890N型氣相色譜儀，全自動進樣裝置、石英毛細管柱及氫火焰離子化檢測器。在下述色譜條件下平行分析磷脂脂肪酸甲酯混合物標樣和待檢樣本:二階程序升高柱溫，170℃ 起始，5℃/min升至 260℃，而后40℃/min升溫至310℃，維持 90 s;汽化室溫度250℃，檢測器溫度300℃;載氣為H2(2 mL/min)，尾吹氣為N2(30 mL/min);柱前壓68.95 kPa;進樣量1 μL，進樣分流比100 ∶l，電子轟擊電離源(EI)到質譜檢測，峰面積通過計算機自動積分。

土壤微生物種類的磷脂脂肪酸(PLFAs)的生物標記識別采用 Cavigelli［15］和 Zelles［16］的方法。

1.5 數據分析

數據采用SPSS(PASW)18.0軟件進行ANOVA方差分析和Duncan’s新復極差法多重比較，并進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤化學性質的影響

土壤pH值與土壤微生物活性、土壤肥力以及作物生長等密切相關。茶園紅黃壤經培肥后，不同處理的土壤pH，未有明顯差異，為5.40～5.68，屬于弱酸性或酸性(表1)。土壤有機質含量與土壤肥力水平呈正相關，可表征土壤肥力的高低。由表1可知，土壤有機質、全氮、全磷、水解氮、有效磷和速效鉀均以全量有機肥處理(O)最高，其次為NPKOL處理。與CK處理相比，3種含有機肥的培肥處理(NPKO、O和NPKOL)的土壤有機質含量明顯增加，分別增加 89.19%、227.84%和 129.26%，CK、NPK、NPKL處理間差異不顯著。NPK、NPKO、O、NPKL、NPKOL處理土壤全氮含量分別比CK增加了 14.29%、123.81%、360.32%、39.68%、171.43%，NPKO、O、NPKOL處理的土壤全磷含量分別是CK處理的3.10、6.75、4.05倍;NPKO、O、NPKOL處理的水解氮含量分別比CK處理增加了84.86%、175.22%、159.40%;有效磷含量分別增加了11.66、16.19、41.54、34.35、10.02倍;NPK、NPKO、O、NPKL、NPKOL處理土壤速效鉀含量分別比 CK增加了 73.06%、209.61%、367.25%、86.52%、334.64%。

2.2 不同施肥處理對土壤可培養微生物的影響

由表2可知，CK和NPK處理的可培養微生物數量無顯著差異。NPK配施有機肥(NPKO)、單施有機肥(O)、NPK配施豆科牧草(NPKL)、NPK配施有機肥和豆科牧草(NPKOL)處理的可培養細菌、放線菌和真菌數量與CK比較均有顯著提高，提高幅度分別為255.3% ～455.3%、172.1% ～286.0%和60.8% ～190.2%。其中NPKOL可培養細菌的數量高于其他處理，與CK相比，提高幅度達455.3%;O和NPKOL處理可培養放線菌的數量顯著高于其他處理，分別比CK提高了286.0%和225.6%;NPKL處理的可培養真菌數量達到最大，比 CK提高了190.2%。

表1 不同施肥處理土壤的化學性質Table 1 The basic soil characteristics under different fertilization treatments

表2 不同施肥處理土壤中可培養細菌、放線菌和真菌數量Table 2 The number of soil culturable bacteria，actinomyces，and fungi under different fertilizations

2.3 不同施肥處理對土壤微生物量的影響

從表3可以看出，與 CK相比，NPK處理和NPKO處理土壤微生物量碳(SMBC)和微生物量氮(SMBN)的值均下降，而O、NPKL和NPKOL則有不同程度的提高，其中NPKOL處理的SMBC和SMBN的值最高，分別為129.00、28.98 mg/kg，比對照分別提高了142.66%和66.17%。各種施肥處理SMBC/SMBN的值均比CK處理高，提高值為0.39～3.24，提高幅度為14.33% ～119.1%，其中NPKL處理最高，比CK高119.1%。但是方差分析結果表明，各種施肥處理的微生物量碳、微生物量氮和微生物量碳/微生物量氮的值與CK相比均未達到顯著性差異。

2.4 不同施肥處理對土壤酶活性的影響

酶活性與微生物群落之間關系密切，能夠快速反饋土地管理措施的改變。表4結果顯示，不同施肥處理茶園土壤各種酶活性存在不同程度的差異。土壤過氧化氫酶酶活性除NPKL比CK降低外，其他施肥方式均有一定程度的提高，提高幅度為9.68%～29.03%，其中NPKOL處理高于其他培肥方式。方差分析表明，各處理間的差異不顯著。與CK相比，土壤轉化酶酶活性均有不同程度提高，提高幅度為14.86% ～106.34%，其中NPKL處理提高程度最大，NPKOL次之。方差分析表明，NPKL和NPKOL轉化酶活性均顯著高于其他施肥處理，其他施肥處理與CK差異不顯著。土壤脲酶酶活性除NPKL比CK有所降低外，其他施肥方式均有不同程度的提高，提高幅度為22.04% ～84.06%，其中NPKOL＞NPKL＞O＞NPKO。方差分析表明，NPKL和NPKOL轉化酶活性均顯著高于其他施肥處理，其他施肥處理與CK差異不顯著。與CK相比，土壤酸性磷酸酶活性除NPKL和NPKOL處理有一定程度的提高，其余施肥處理均有所下降。NPKL和NPKOL的提高幅度分別為19.91%和20.35%。方差分析表明，NPKL和NPKOL酸性磷酸酶活性均顯著高于CK處理。

表3 不同施肥處理的土壤微生物量Table 3 Soil microbial biomass under different fertilizations

表4 不同施肥處理的土壤酶活性Table 4 Soil enzyme activity under different fertilizations

2.5 不同施肥處理對土壤微生物PLFAs的影響

不同種類微生物的磷脂脂肪酸(PLFAs)的組成及含量存在差異，所以測定土壤中所有微生物的磷脂脂肪酸種類和含量即可估計土壤中微生物生物量和群落結構［17］。供試土壤共檢測到24種特定的PLFAs，不同施肥處理的PLFAs的相對豐度存在差異。放線菌PLFAs和革蘭氏陽性菌PLFAs相對豐度的變化趨勢為NPKL和NPKOL處理明顯高于其他處理(表5)，革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌PLFA的變化趨勢也是NPKL和NPKOL顯著高于其他處理，說明豆科牧草能刺激革蘭氏陽性菌和放線菌的生長;真菌和厭氧細菌PLFAs相對豐度的變化趨勢一致，均為NPKOL＞O＞NPKL＞NPKO＞CK＞NPK，多年施化肥降低了真菌PLFAs相對豐度，而NPKOL處理則顯著提高;細菌PLFAs相對豐度和細菌/真菌的變化趨勢為CK、NPK和NPKO處理高于其他處理;革蘭氏陰性PLFAs相對豐度變化趨勢為NPK＞O＞CK＞NPKO＞NPKL＞NPKOL;環丙基脂肪酸/單烯基前體PLFAs的變化趨勢為NPK和CK處理高于其他處理。

表5 不同施肥處理土壤PLFAs類型和相對豐度Table 5 Types and relative abundance of PLFAs under different fertilizations

主成分分析表明，第一主成分和第二主成分的方差貢獻率分別為49.2%和36.9%，兩者總和達86.1%，可用于反映系統的變異信息。由圖1可知，不同施肥處理土壤微生物群落結構存在差異，NPK和CK處理聚為一類，位于第三象限;NPKO處理單獨聚為一類，位于第二象限;其余施肥處理聚為一類，均位于第一象限。同時由圖2可知，放線菌、真菌、革蘭氏陽性菌、厭氧細菌和革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌PLFAs變異信息處于第一主成分右端，表明單施有機肥(O)和配施豆科牧草(NPKL、NPKOL)均能提高這些菌種的相對豐度。細菌和細菌/真菌PLFAs與PC1呈顯著負相關，革蘭氏陰性菌與PC2呈顯著負相關，說明CK和NPK能增加土壤細菌和革蘭氏陰性菌的相對豐度，NPKO處理能明顯增加土壤細菌相對豐度。

圖1 不同施肥處理土壤微生物PLFAs主成分圖Fig．1 Principal component plot for PLFAs of varying microbes under different fertilizations

各指標間的相關分析可知(表6)，微生物量與微生物PLFAs相對豐度之間顯著相關，微生物量與脲酶、酸性磷酸酶活性也顯著相關。可培養微生物與微生物PLFAs相對豐度之間相關性也較為顯著。但微生物PLFAs相對豐度分別與微生物量、可培養微生物數量之間的相關性均明顯高于多數酶活與微生物量、可培養微生物數量之間的相關性。

圖2 土壤微生物PLFAs主成分負載值圖Fig．2 PCA showing loading values for PLFAs of varying microbes

3 討論

3.1 不同施肥處理對土壤化學性質的影響

不同培肥模式均有利于改善茶園紅黃壤化學性質，土壤有機質、全氮、水解氮、速效鉀含量均有不同程度的增加，特別是含有機肥的3種培肥模式(NPKOL、O和NPKL)的土壤化學改良效果更為顯著，增強了土壤的保肥供肥能力。

3.2 不同施肥處理對土壤生物學性狀的影響

本研究表明，與不施肥處理相比，單施無機肥茶園土壤可培養細菌、放線菌和真菌的數量均無顯著變化，而其他施肥處理細菌、放線菌和真菌等3大類微生物種群的數量均有不同程度的提高，其中NPKOL、O和NPKL處理土壤這3類微生物的數量分別達到最大。這是因為(除NPK處理外)其他施肥處理茶園土壤有機質、全氮、全磷等均有不同程度的提高，這些土壤化學性質的改善有利于增加可培養微生物數量。這與以往的研究結論基本一致［18－19］。同時林新堅等［6］的結果得出，NPKOL 處理對茶葉產量和茶葉營養物質的累積效果最佳。以上說明NPKOL施肥模式在提高茶葉產量、品質和土壤微生物數量上明顯優于其他施肥方式。另外，化肥處理的土壤3大類微生物種群的數量與不施肥相比均無明顯差異，這與 He等［18］、單武雄等［20］發現單施化肥能提高土壤可培養微生物數量的結論不一致，可能是由于本研究中單施化肥導致土壤pH值、有機質含量降低［6］，不利于微生物繁育所致。

表6 各指標間的相關分析(r)Table 6 Correlation analysis between different indicators

土壤微生物量是土壤養分重要的“源”和“匯”，能夠反映微生物在土壤中的實際含量和作用潛力［21－22］。本研究中，O、NPKL 和 NPKOL 施肥模式與CK和NPK施肥模式相比均可在一定程度上提高土壤微生物碳(SMBC)和土壤微生物氮(SMBN)，其中NPKOL處理下最高。這與張平究等［23］、徐陽春等［24］的研究結果相吻合，表明有機無機肥配施能明顯提高土壤微生物量碳、氮，有利于改善土壤質量。與CK相比，NPK處理SMBC和SMBN的值均有下降趨勢，這與黃泥土［23］、黃土高原旱地［25］和黑土［26］所得的結果均相反，這可能在一定程度上是由試驗用的土壤種類差異引起。

土壤酶能夠表征土壤物質和能量的代謝水平和土壤質量。本研究中，NPKOL處理過氧化氫酶活性最高，其他施肥處理與CK處理間無顯著差異。這與徐晶等［27］的結果不完全一致。也有文獻也指出，過氧化氫酶不能表征肥料對土壤肥力的影響［8］。因此，過氧化氫酶活性作為培肥過程中土壤肥力變化的評價應慎用。各施肥處理均不同程度提高土壤轉化酶活性，其中NPKL和NPKOL處理均能顯著增加轉化酶活性，因為這兩個處理均套種具有固氮作用的豆科牧草，能刺激植物根系生長，并促進微生物繁育，進而促使植物根系和微生物分泌更多轉化酶。除NPK外，其他施肥處理脲酶活性均比CK處理高，其中NPKOL最高，NPKL次之。這與任泉等［28］的研究結論相一致，主要是因為有機肥能夠刺激植物根系生長，同時有機肥本身含有大量的微生物和豐富的酶，這些都有利于土壤脲酶活性的提高。同時套種豆科牧草，其具有固氮作用，能顯著提高土壤的供氮水平，從而顯著提高脲酶活性。磷酸酶在有機磷礦化中起著重要作用，可表征土壤的供磷能力。本研究中，NPKL和NPKOL處理土壤酸性磷酸酶活性顯著高于不施肥處理，而其他施肥處理酶活性均低于不施肥處理。

本試驗表明，微生物群落組成相似性在NPK和CK處理中較高;而O、NPKL和NPKOL處理的相似性較高，且微生物種群多樣性豐富。于樹等［17］的研究也發現，單施化肥處理的土壤微生物群落結構與長期不施肥的較相似，微生物種群多樣性單一，沒有明顯的優勢種群，而有機無機配施的土壤微生物群落與不施肥相比差異較大。白震等［29］研究表明，革蘭氏陰細菌菌或革蘭氏陽細菌菌脂肪酸更易受有機肥影響。這些研究都表明，施用有機肥對土壤微生物群落結構的影響與單施無機肥相比效果更加明顯。環丙基脂肪酸/單烯基前體比值在協迫條件如土壤酸化、低氧或高溫下升高［30］。研究結果顯示，相對其他施肥處理，NPK處理此比率最高。由主成分分析圖可知，CK與NPK聚為一類，說明NPK施肥模式不利于茶園土壤微生物的生存和發育。

3.3 土壤微生物指標間的相關分析

相關分析表明，微生物PLFAs相對豐度分別和微生物量、可培養微生物數量之間的相關性明顯高于多數酶活性與微生物量、可培養微生物數量之間的相關性，這表明微生物PLFAs相對豐度較土壤酶活性對施肥處理的反映更為敏感。這可能是因為土壤酶是由微生物和植物根系等共同產生，同時有部分土壤微生物處于休眠狀態，其代謝活性下降，分泌的酶量變少，導致酶活性與微生物量和可培養微生物數量之間的相關性較低。

4 結論

茶園土壤的各培肥模式不同程度影響土壤可培養微生物數量、微生物量碳氮和土壤酶活，同時改變微生物群落結構。單施化肥不利于微生物的生長和酶活的提高，而“無機肥+有機肥+豆科牧草”的培肥模式下各微生物指標總體趨勢均顯著優于其他培肥模式，說明該培肥模式有助于改良土壤的生物學性質，應進一步推廣和利用。

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