NGFIB-β在大鼠大腦皮層神經細胞分化中的表達研究

畢海濤 喬曉溫 史為博 賈景娜 王杰 李英敏

孤兒核受體神經生長誘導基因B-β(nerve growth factor-induced gene B-β，NGFIB-β)是孤兒核受體家族中的一員［1］，因缺乏與配體相互結合的能力又稱為非配體依賴性受體。NGFIB-β主要表達在中樞神經系統，與中腦的多巴胺能神經細胞的分化有密切關系［2］。敲除NGFIB-β基因的小鼠在生后24 h內很快死亡，并有黑質和腹側被蓋區多巴胺能神經細胞的缺失，表明NGFIB-β是中腦多巴胺能神經細胞分化、遷移、成熟及存活重要的調控因子［3］。Zetterstrom 等［4］通過原位雜交報道了成熟小鼠及胚胎NGFIB-βmRNA在中樞神經系統的表達，但在中腦以外非典型多巴胺能神經細胞區域大腦皮層發育過程中NGFIB-β的蛋白表達狀態及與神經細胞分化成熟的相關關系未見報道，本研究使用NGFIB-β小鼠單克隆抗體，采用免疫組化染色，觀察了大鼠大腦皮層發育過程中NGFIB-β蛋白表達的動態變化及與細胞分化成熟的相關關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗采用Wistar大鼠，由河北醫科大學實驗動物中心提供，清潔級，動物合格證號：1003045，在河北醫科大學實驗動物中心常規標準飼養。大鼠在乙醚吸入深麻醉狀態下，頸椎脫髓處死。成熟大鼠5只、孕12～19 d妊娠大鼠(每天5只)、生后1～15 d的幼鼠(選擇不同孕鼠出生后的個體每天5只)，處死后立刻取出大腦皮層組織。

1.2 試劑 小鼠抗人抗大鼠NGFIB-β單克隆抗體購自英國abcam公司;免疫組化二步法試劑(LDP，labelled dextran polymer)購自北京中杉生物公司。

1.3 實驗方法 組織經10%的中性甲醛溶液固定后，各級濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。免疫組化采用LDP法，首先用L-Lysine處理玻片，連續石蠟切片(4μm)，60℃烘干1 h，常規脫蠟、水化組織切片，微波抗原修復98℃，15 min(將切片置于0.01 mol/L pH值6.0的檸檬酸緩沖液中)，自然冷卻至室溫;切片用蒸餾水洗3 min×1，PBS洗3 min×2;3%H2O2處理10 min以抑制內源性過氧化物酶，PBS洗3 min×3;滴加NGFIB-β單克隆抗體(1∶150)，濕盒內4℃過夜;PBS洗3 min×3，滴加 LDP孵育 30 min，PBS洗 3 min×3;DAB顯色 5～10 min，水洗后，蘇木素復染、常規脫水、透明，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 大鼠大腦皮層發育過程中NGFIB-β表達呈顯著動態變化首先在孕16 d觀察到正在發育中的大腦皮層有少量陽性表達，陽性細胞主要位于大腦皮層的第Ⅴ、第Ⅵ層(圖1a);孕18有陽性細胞有增多趨勢(圖1b);生后1～5 d的表達達到高峰且Ⅱ～Ⅵ層均可見多量陽性細胞(圖1c，1d)，生后7之后隨著細胞的成熟陽性細胞又逐漸減少，生后13陽性細胞明顯減少，主要集中在Ⅴ～Ⅵ層(圖1e);生后36(成熟)僅在Ⅴ～Ⅵ層見個別陽性細胞(圖1f)。

2.2 NGFIB-β的陽性結果判定 陽性細胞為棕黃色(細胞核內表達)。用普通光學顯微鏡在大腦皮層隨機選擇5個高倍(×400倍)視野，每個視野分別計數500個細胞，最后取平均值，0：(-)＜10%：(±);＞10%：(+);＞25%：(++);＞50%：(+++)(表1)。

圖1 大鼠大腦皮層發育過程中NGFIB-β的表達(免疫組化×400)

表1 NGFIB-β在大鼠大腦皮層發育過程中的表達

3 討論

神經細胞不能進行正常分化時，會導致神經發育異常，引發多種疾病。原發性智障［5］、原發性癲癇［6］等疾病就是因為神經細胞分化遷移異常而造成的。NGFIB-β是細胞內核受體家族中的一員，Torii等［7］發現，人類 NGFIB-β基因定位于2q22-23區帶上，長約8.3 kb，由8個外顯子和7個內含子構成。NGFIB-β廣泛表達于腦組織不同部位的神經細胞中［8］，敲除NG FIB-β基因的小鼠中腦多巴胺能神經細胞在E15.5出現了分化及分布的異常，出生后小鼠活動能力低下，生后24 h內即告死亡，免疫組化技術表明小鼠黑質和腹側被蓋區均無多巴胺能神經元酪氨酸羥化酶和芳香族氨基酸脫羧酶基因表達，也無多巴胺神經遞質產生，多巴胺能前體細胞不能遷移到其正常定居部位，難以與靶目標建立有效的突觸連接，神經細胞凋亡也明顯增加。

迄今為止的研究已證明NGFIB-β在中腦黑質和腹側被蓋區多巴胺能神經細胞分化、遷移、成熟和生存等方面有重要作用［9，10］但中腦以外非典型多巴胺能神經細胞區域蛋白表達狀態及意義未見報道，大腦皮層屬于非典型多巴胺能神經細胞區域，本研究采用免疫組化觀察了大鼠發育過程中大腦皮層NGFIB-β蛋白表達的動態變化，實驗結果顯示在大鼠大腦皮層發育過程中NGFIB-β的表達呈現了一個較為短暫的顯著的動態變化，NGFIB-β首先在E 16 d大腦皮層的深部(第Ⅴ、Ⅵ層)出現少量表達，之后隨著發育的進行陽性表達明顯增多，生后1～5 d的表達達到高峰且Ⅱ～Ⅵ層均可見多量陽性細胞，P7之后隨著細胞的成熟陽性細胞又逐漸減少，P13時陽性表達主要集中在Ⅴ～Ⅵ層，成熟的大腦皮層僅在Ⅴ～Ⅵ層見個別陽性細胞，這種表達呈明顯的時間和空間特點，而且NGFIB-β陽性細胞顯示已分化的形態，隨著細胞的分化成熟陽性表達明顯減少，而且大腦皮層組織屬于非典型多巴胺能神經細胞區域，可以肯定的說這些陽性細胞并不是多巴胺能神經細胞，本研究提示NGFIB-β在中腦以外非典型多巴胺能區域的大腦皮層組織神經細胞的分化遷移至成熟過程中擔當角色。

1 Law SW，Conneely OM，DeMayo FJ，et al.Identification of a new brainspecific transcription factor，NURRl.Mol Endocrinol，1992，6：2129-2135.

2 Le WD，Xu P，Jankovic J，et al.Mutations in NR4A2 associated with familial Parkinson disease.Nat Genet，2003，33：85-89.

3 Wallen A，Zetterstrom RH，Solomin L，et al.Fate of mesencephalic AHD2-expressing dopamine progenitor cells in NURR1 mutant mice.Exp Cell Res，1999，2：737-746.

4 Zetterstrom RH，Williams R，Perlmann T，et al.Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions includeng the nigrostriatal dopamine system.Brain Res Mol Brain Res，1996，1：111-120.

5 Barth PG.Disorders of neuronal migration.J Neurol Sci，1987，14：1-16.

6 Gordon N.Epilepsy and disorders of neuronal migration.II：Epilepsy as a symptom of neuronal migration defects.Dev Med Child Neurol，1996，38：1131-1134.

7 Torii T，Kawarai T.Nakamura S，et al.Organization of the human orphan nuclear receptor Nurr1 gene.Gene，1999，230：225-232.

8 Perlmann T，Jansson L.A novel pathway for vitamin A signaling mediated by RXR heterodimerization with NGFI-Band Nurr.Genes Dev，1995，9：769-782.

9 Chung S，Sonntag KC，Andersson T.Genetic engineering of mouse embryonic stem cells by Nurr1 enhances differentiation and maturation into dopaminergic neurons.Eur J Neurosci，2002，16：1829-1838.

10 Haas SJ，Wree A.Dopaminergic differentiation of the Nurr1-expressing immortalized mesencephalic cell line CSM14.1 in vitro.Anatomy，2002，201：61-69.