中藥六味地黃湯抗大鼠卵巢組織衰老的機制

王方娜 李亞麗 楚偉 何金波

衰老是一個復雜的形態與功能變化的過程，細胞周期停滯于G1期是細胞衰老的一個關鍵特征。目前研究較為明確的細胞衰老途徑主要有兩條［1］：p19ARF/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb途徑。這兩條衰老途徑的關鍵調節因子是幾個抑癌基因：p53、p19ARF、Rb和p16INK4a。一旦這些基因發生突變，細胞將發生早老或繞過衰老程序繼續增殖。因此通過抑制衰老途徑中相關基因表達的治療已成為防治衰老的新策略。近年來大量文獻報道性腺功能衰退與機體衰老密切相關［1，2］。研究性腺衰老機制及藥物的調節作用已成為衰老研究的熱點之一，而且主要集中在雄性性腺衰老的研究［2-4］，但對于雌性性腺衰老的研究報道尚少。本研究應用D-半乳糖連續腹腔注射法制造雌性大鼠亞急性衰老模型，以大鼠卵巢為研究對象，應用RTPCR、Western blotting方法檢測并分析應用六味地黃湯對衰老大鼠卵巢組織p16、p19ARF、Rb表達的影響，探討六味地黃湯在衰老途徑中抗鼠性腺衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用清潔級8周齡雌性SD大鼠75只，體重180～220 g(購自河北醫科大學實驗動物學部，合格證編號：605106)。根據實驗目的和要求將SD大鼠隨機分為以下各組，正常對照組、模型組、六味地黃湯組、VE陽性對照組，每組15只。

1.2 動物模型的建立和4組動物的處理 用D-半乳糖連續腹腔注射建立亞急性衰老動物模型：用0.9%氯化鈉溶液配成6%的溶液，按300 mg·kg-1·d-1給藥，連續60 d，1 次/d。六味地黃湯組和陽性對照組大鼠在造模的同時每天灌胃六味地黃湯、維生素E，連續60 d。

1.3 藥物溶液的制備 六味地黃湯方劑組成：熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉等，按重量比 8∶4∶4∶3∶3∶3比例混合，剪碎，水浸泡1 h，然后水煎2次，30 min/次，過濾后濃縮至含生藥為1 g/ml。4℃保存，給藥前復溫至25～30℃。維生素E溶液：用0.5%羧甲基纖維素鈉稀釋為含維生素 E 0.0055 g/ml藥液。4℃保存，給藥前復溫至25～30℃。

1.4 方法

1.4.1 設備與試劑：D-半乳糖購于北京化學試劑公司;TUNEL試劑盒購自Roche生物試劑公司;β-Actin單克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司;PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供;PCR儀(美國MJResearch公司);羊抗Rb多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司;Gel-Pro Analyzer 4.0電泳圖像定量分析系統購自美國media cybernetics公司。

1.4.2 RT-PCR的檢測：總RNA的提取按Trizol Reagent說明書進行。PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。見表1。

表1 RT-PCR分析的引物

PCR過程：以總RNA為模板，以Oligo(dT)16為引物，按AMV(Promega)說明書反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，加入p53 cDNA上、下游引物，以 β-actin為內參照，進行 PCR。PCR擴增反應體系：取5μl反轉錄產物作為PCR反應模板，依次加入 dNTPs混合物(終濃度 0.2 mmol/L)，MgCl22.5 mmol/L，上、下游引物(終濃度50 pmol/L)，10×PCR緩沖液2.5μl，Taq DNA聚合酶2 U，加無菌去離子水至總體積25μl，置PCR儀上進行擴增。設定反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，30 個循環后，72℃延伸7 min。最后取10μl PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，運用凝膠成像系統對條帶進行吸光光度值分析。以p53/β-actin平均吸光度比值表示p53的mRNA水平，進行半定量分析。

1.4.3 Rb蛋白含量的檢測：大鼠斷頭處死，取出垂體、卵巢組織迅速投入液氮中，待用。卵巢細胞Rb蛋白提取及Western Bloting法檢測各組大鼠卵巢Rb蛋白的檢測，將組織從液氮中取出，研磨器中加入少許細胞裂解液(0.15 mol/L，NaCl，5 mmol/L，EDTA，1%TritonX-100，10 mmol/L，pH 值 7.4 Tris-HCl，1∶1 000 的 5 mol/L DTT，1∶1000 的100 mmol/L PMSF)，將組織研磨成漿后離心取上清。用蛋白定量測定試劑盒進行總蛋白測定，獲得每個組織的總蛋白濃度。電泳分離蛋白。用TBST清洗PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，分別加入Rb、β-actin等抗體(抗體稀釋度1∶200 ～1∶500)，搖床常溫孵育1 h，4℃過夜，TBST清洗，15 min/次，3次;加入過氧化物酶標記的二抗，(用含2.5%脫脂奶粉的TBST稀釋，稀釋度為1∶1 000)，搖床常溫孵育1 h，TBST清洗，5 min/次，3次。在PVDF膜上滴加酶的作用底物ECL，作用3 min后濾紙吸干，塑料保鮮膜包裹后放入暗匣，壓X光底片曝光2～5 min，顯影，定影。將清晰的條帶掃描后輸入圖像分析系統，結果以Rb/β-actin的OD比值表示。

1.5 統計學分析應用SPSS11.5統計軟件，計量資料以±s表示，采用One-Way ANOAY方差分析，均數間兩兩比較進行SNK法Q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR結果 在正常大鼠卵巢組織中，p53、p19ARF、Rb、p16基因表達較低，模型組大鼠卵巢組織內p53、p19ARF、Rb、p16表達上調(P＜0.05)，給予六味地黃湯治療后可以降低其表達(P ＜0.05)。見表1。

表1 各基因mRNA在大鼠卵巢組織中轉錄水平的分析結果n=15，±s

表1 各基因mRNA在大鼠卵巢組織中轉錄水平的分析結果n=15，±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

六味地黃湯組 0.39±0.04# 0.59±0.01# 0.62±0.06# 0.75±0.012#VE陰性對照組 1.90±0.07*# 0.65±0.05*# 0.80±0.01*#1.05±0.21*#

2.2 Westernbloting結果 在正常大鼠卵巢組織中，Rb蛋白表達較低，模型組大鼠卵巢組織內 Rb蛋白表達上調(P＜0.05)，給予六味地黃湯治療后可以降低明顯其表達(P＜0.05)。見表2。

表2 Rb蛋白在大鼠卵巢組織中表達水平的分析結果±s

表2 Rb蛋白在大鼠卵巢組織中表達水平的分析結果±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

模型組六味地黃湯組 0.59±0.16#VE陽性對照組 0.81±0.31*#

3 討論

p53基因是一種抑癌基因，亦是衰老基因，在p53衰老途徑中，p19ARF是p53的正性調節因子，p19ARF蛋白可以抑制MDM2的活性，使其不能介導p53的降解，從而激活p53，而高度活化的p53促進細胞衰老［5］。在調控細胞老化的Rb途徑中，p16、Rb基因的表達及功能的改變是細胞周期停滯的根本原因。Rb蛋白以其不同的活性狀態調控著細胞G1-S調控點，決定細胞增殖或進入生長停滯。p16蛋白是一種細胞周期抑制蛋白，可以阻斷CDK4-6途徑對Rb蛋白的磷酸化，非磷酸化的Rb蛋白與轉錄因子E2F相結合，阻止細胞進入S期，使細胞周期停滯，Rb與p16相互作用，影響著細胞的衰老［6］。這兩條衰老途徑中任何一條途徑活化均可以導致細胞衰老，但兩條途徑間存在著廣泛的多層次的聯系，常常共同參與細胞衰老過程。

本研究結果顯示：D-半乳糖誘導的衰老大鼠卵巢組織p53、p19ARF、Rb以及p16基因表達明顯比正常組上調，說明衰老模型大鼠的卵巢組織表達衰老信號。應用六味地黃湯后，大鼠卵巢組織的p53、p19ARF、Rb以及p16的表達均下降，因此推測p19ARF/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb兩條衰老途徑在大鼠卵巢組織衰老的過程中可能均發揮重要的作用。

綜上所述，六味地黃湯不僅在基因水平抑制了大鼠卵巢的衰老，而且這種抑制作用也表現在分子水平。六味地黃湯是通過抑制兩條衰老途徑中關鍵的調節因子發揮作用，繼而可能抑制了衰老信號進一步向下游轉導，從而起到抗衰老的作用。因此，六味地黃湯是一種具有良好應用前景的抗衰老藥物。

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4 李然，付淑華，張杰，等.中藥何首烏飲對衰老大鼠睪丸組織NO和iNOS 含量的影響.承德醫學院學報，2012，29：3-5.

5 Itahana K，Campisi J，Dimri GP.Mechanisms of cellular senescence in human and mouse cells.Biogerontology，2004，5：1-101.

6 Molofsky AV，He S，Bydon M，et al.Pardal R.Bm i-1promotes neuralstem cell se lf-renewal and neural development but not mouse growth and survival by repressing the p16Ink4a and p19ARF senescence pathways.Genes Dev，2005，19：1432-1437.