原發性乳腺癌組織中類干細胞檢測及臨床意義

屈志鋼 楊超 左燕紅 黃麗娟 王鵬 趙鳳云 劉運江

在我國乳腺癌發病率以每年3%的速度遞增，且發病年齡趨向年輕化。盡管目前乳腺癌的綜合治療顯著改善了患者的生存期，但復發和轉移風險仍然很高。目前干細胞理論認為，腫瘤中只要一小部分具有干細胞表型的腫瘤細胞移植后，就能夠重新形成腫瘤，并且具有自我更新、形成不同分化程度的腫瘤的能力，腫瘤組織中腫瘤干細胞的存在及數量是腫瘤復發和轉移的根源［1］。但乳腺癌干細胞一直缺乏有效的鑒別和分離方法，我們參照Xu等［2］的實驗，采用流式細胞技術檢測乳腺癌組織中的CD55hig的細胞比例來代替乳腺癌類干細胞，用以判斷患者的預后及復發的風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2008年2月至2009年1月在河北醫科大學第四醫院外一科診治的原發性乳腺癌患者45例，均為女性，年齡30～72歲，中位年齡46歲。根據國際抗癌聯盟(2002版)腫瘤分期標準：Ⅰ期11例，Ⅱ期26例，Ⅲ期8例;根據腋淋巴結有無轉移分為：無淋巴結轉移16例，淋巴結轉移1～3枚16例，淋巴結轉移≥4枚13例;按乳腺腫瘤病理組織學分類標準：浸潤性導管癌33例，浸潤性小葉癌7例，其他類型乳腺癌5例;根據C-erbB2表達情況分為：陽性(++～+++)患者33例，陰性(-～+)患者12例;根據ER表達情況分為：陽性(+～+++)患者30例，陰性(-)患者15例;根據PR表達情況分為：陽性(+～+++)患者26例，陰性(-)患者19例;根據Ki67蛋白的表達情況分為：陽性(+～+++)患者32例，陰性(-)患者13例。選取病例中，8例曾行新輔助化療(化療方案為CEF方案或AC方案，化療周期為2～4個周期)，其余均為首次就診、未經過任何治療的患者。研究對象的腋窩淋巴結轉移狀況、病理學指標根據我院組織活檢和手術標本的病理報告確定，患者的臨床資料來自住院病歷。

1.2 實驗方法 主要儀器、主要試劑及試劑配制 見表1。

表1 主要儀器、主要試劑及試劑配制

1.3 實驗步驟

1.3.1 單細胞混懸液的制備：于手術中按無菌原則切取部分乳腺癌腫塊，同時切取部分遠離癌灶5 cm的乳腺組織作為CK19，CD55免疫熒光標記時的陰性對照，低溫保存，快速到實驗室處理。分別將保存的新鮮腫瘤組織及正常乳腺組織放在120目不銹鋼網上，下置一平皿，用搓網法將組織搓完，將平皿中的混懸液用300目銅網過濾去除細胞團塊，收集細胞懸液后以1 000 r/min離心沉淀2 min，加入PBS 10 ml洗滌1次，棄上清，再加入PBS10 ml洗滌1次，棄上清。

1.3.2 細胞的免疫熒光標記：取乳腺癌組織單細胞混懸液及正常乳腺組織單細胞混懸液各1×106/ml，同時加入鼠抗人CD55-FITC原液、鼠抗人CK19-PE原液各20μl，避光、室溫孵育30 min。加入適量PBS緩沖液以1 000 r/min離心沉淀2 min。上機檢測前加入經500目銅網過濾后的PBS 0.1 ml。將乳腺癌組織及對照組織混懸液以鼠抗人CD55、鼠抗人CK19工作液(兩種不同的熒光顯色標記)進行雙標，然后采用流式細胞術方法進行上機檢測，其中遠離癌組織5 cm的乳腺組織的單細胞懸液設為陰性對照。用流式細胞儀測定乳腺癌腫瘤細胞表面CD55表達：選擇氬離子激光激發，激發波長為488 nm，測定中以前向角散射(FSC)對側向角散射(SSC)設門，調整電壓及增效，圈出CK19+、CD55hig細胞群。

1.4 結果判定標準 本研究參照Xu等［2］的研究方法及結果判定標準，采用乳腺癌細胞株MDA-MB-231進行CD55檢測，檢測中以癌細胞表面受體大量結合CD55抗體的主峰處的熒光密度值為界值，超出此界值即定義為CD55hig，以此為界值設門分析，避免非上皮細胞的干擾，獲取門內細胞個數。實驗結果用Expo 32 ADC軟件進行分析，得到CK19+、CD55hig熒光雙標陽性細胞的百分數。

1.5 統計學分析應用SPSS13.0統計軟件，計量資料以±s表示。兩個樣本均數的比較應用Wilcoxon符號秩檢驗(散點圖中樣本成偏態分布)，3組樣本均數的差別比較應用Kruskal-Waillis H檢驗(散點圖中樣本成方差不齊)，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD55hig水平比較 乳腺癌腫瘤組織中CD55hig的細胞群比例均數為(0.21±0.20)%，較乳腺癌細胞株MDA-MB-231所測CD55hig的比例(0.36±0.22)%低。

2.2 CD55hig細胞比例在淋巴結轉移間比較 CD55hig的細胞比例在腋淋巴結無轉移組，1～3個腋淋巴結轉移組和≥4個腋淋巴結轉移3組間比較，差異有統計學意義(χ2=16.86，P=0.000)。CD55hig細胞群比例在腋淋巴結無轉移組、在1～3個腋淋巴結轉移組、≥4個腋淋巴結轉移組間兩兩比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 CD55hig群細胞的比例在淋巴結轉移不同組間的比較%，±s

表2 CD55hig群細胞的比例在淋巴結轉移不同組間的比較%，±s

注：(1)：(2)，P=0.000;(1)：(3)，P=0.000;(2)：(3)，P=0.019

≥4枚淋巴結轉移(3)(n=13)0.390±0.069

2.3 不同C-erbB2時CD55hig細胞群比例表達 乳腺癌組織中C-erbB2(++～+++)組的CD55hig的細胞群比例(0.277±0.034)%，較 C-erbB2(-～+)組的 CD55hig的細胞群比例(0.028±0.005)%有明顯的升高，差異有統計學意義(P=0.000)。見表3。

表3 CD55hig群細胞的比例在不同C-erbB2表達組間的比較%，±s

表3 CD55hig群細胞的比例在不同C-erbB2表達組間的比較%，±s

++～+++(n=33)0.277±0.034

2.4 CD55hig群細胞不同分期及 ER、PR、Ki67中的表達CD55hig的細胞比例在乳腺癌不同病理類型之間、不同臨床分期之間、ER(-)，ER(+ ～ +++)組之間、PR(-)，PR(+ ～ +++)組之間、Ki67(-)，Ki67(+～+++)組之間的差異均無統計學意義(P＞0.05)，CD55hig細胞群的比例在術前化療與未化療比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4、5。

3 討論

3.1 乳腺癌類干細胞的分離鑒別依據 最近越來越多的證據顯示腫瘤組織及腫瘤細胞系中的細胞存在著等級性，即不同分化階段的細胞，其中一部分腫瘤細胞在啟動腫瘤形成和維持腫瘤生長中起決定性作用，其作用與正常干細胞相似，被命名為腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)［1］，或稱為腫瘤類干細胞(cancer stem-like cells，CSLC)。研究發現，乳腺癌組織中亦存在類干細胞，稱之為乳腺癌類干細胞(mammary cancer stem-like cell，MCSC)。它具有永遠增殖和自我更新能力，可能為乳腺腫瘤轉移和復發的根本原因［3］，而且它還具有逃避免疫監視，躲避化療藥物殺傷的特性［4-6］，目前研究認為乳腺癌組織中類干細胞的含量越高，腫瘤轉移和復發的機會越大，預后越差［7，8］。由此可見，通過測定乳腺癌中的類干細胞含量可以反映腫瘤組織的生長情況：當CSLC的比例很高時，機體對其失去了正常的調控能力，此時患者可能處于腫瘤進展及向外播散轉移期;而當其比例很低時，腫瘤組織處于穩定生長狀態或已被當前治療所控制。因此測定CSLC的含量可以幫助我們判斷病情和估計預后。

表4 CD55hig群細胞的比例在不同臨床分期、不同病理類型、不同ER、PR、Ki67表達組間的比較

表5 化療與未化療患者CD55hig表達比較%，±s

表5 化療與未化療患者CD55hig表達比較%，±s

未化療(n=37)0.209±0.035

一直以來乳腺癌類干細胞缺乏有效的鑒別和分離方法。2002年，Clarke等［9］首次成功地從乳腺癌細胞中分離出干細胞，2003年Al-Hajj等［10］從乳腺癌患者組織中分離出CD44+CD24-/low群細胞，經檢測CD44+CD24-/lowESA+lin-群細胞致瘤性提高了50倍，說明了其具有不同于其他腫瘤細胞的生命力。2004年 Kondo等［11］用 Hoechst33342染料排斥法檢出MCF-7乳腺癌細胞系中側亞群(side population，SP)細胞。而干細胞理論認為干細胞及腫瘤干細胞因帶有ABCG2轉運蛋白而具有能將染料泵出表現為染料暗淡的特征，用Hoechst33342染料分選出來的染色暗淡的細胞被稱為SP細胞，產生SP表型的主要原因是因為高表達ABCG2［12］。其他不能將染料泵出的細胞被稱之為MP細胞，通過此方法分離出干細胞。2005年Patrawala等［13］改進了這種分離方法，使用Coulter Epics流式細胞儀將SP與MP分為獨立的兩群，經檢測后發現MCF-7中SP比例為0.2%。

2007年 Xu等［2］從乳腺癌細胞株 MCF-7中分離出CD55hig、CD55low兩部分，分別落在 SP、MP 部分，當 CD55hig群細胞隨培養基耗盡而消失后，SP細胞亦隨之消失，提示采用CD55抗體可以替代 Hoechst33342染料排斥法。隨后 Xu等［2］將CD55hig群細胞和CD55low群細胞分別培養，經觀測，CD55hig群細胞生長良好，并且可以培養出CD55hig和CD55low兩群細胞，具有同MCF-7相近的細胞特點，而CD55low群細胞則不能;他們又將CD55hig群細胞和CD55low群細胞用錐蟲藍染色，觀察細胞凋亡情況：當12 h血清耗盡后生存下來的 CD55hig群細胞遠較CD55low群細胞多，提示CD55hig群細胞生存能力強，具有抵制因血清耗盡而引發的細胞凋亡能力;他們又采用神經酰胺來檢測(神經酰胺是一種可引起細胞凋亡的藥品)，加入神經酰胺后24、48、72 h 后，CD55hig群細胞遠較 CD55low群細胞多，提示CD55hig群細胞比CD55low群細胞生存能力更強;同樣的試驗在乳腺癌細胞株MDA-MB-231中也得到驗證。其后的克隆形成實驗亦顯示CD55hig群細胞的克隆形成效率高于CD55low群細胞，而且CD55hig群細胞還具有進一步分化的能力，因此認為CD55hig群細胞可能是一群具有腫瘤類干細胞樣性質的細胞。因此我們可以通過檢測乳腺癌患者腫瘤中的CD55hig的比例來檢測乳腺癌類干細胞的含量。

CD55是一種促衰變因子(decay accelerating factor，DAF)，其生物學活性及生理功能證實可保護宿主細胞免遭補體介導的溶解破壞［14］。即腫瘤的免疫逃逸現象。有研究表明，CD55與腫瘤細胞的活動度、新生血管形成、細胞凋亡的解救、腫瘤的致瘤性、腫瘤的侵襲及轉移等有關［15］。

3.2 原發性乳腺癌組織中的類干細胞比例的測定及其臨床意義 盡管多項試驗認為CD55hig可以成為乳腺癌類干細胞的標記物，但CD55存在于各種血細胞及其他腫瘤細胞上，表達不具備特異性，所以本試驗需要濾去乳腺癌組織中其他非上皮細胞，僅留下乳腺上皮細胞，以篩選CD55hig群細胞。因此我們采用了CK19+作為篩選標記物。

CK19是一種細胞角蛋白，對乳腺上皮組織具有高度的組織特異性，因為乳腺癌病理類型中大部分為導管上皮來源，所以在乳腺癌中廣泛表達，近年來的試驗也證明CK19是檢測乳腺癌微轉移最有價值的標志物之一［16，17］。

本試驗采用CD55，CK19+雙標(熒光標記顏色不同)，在CK19+篩選過的乳腺上皮細胞中，選取其中的CD55hig(詳見判定標準)群細胞作為乳腺癌類干細胞并測算其比例，從而為乳腺癌患者的病情判斷提供理論依據。

研究結果顯示，CD55hig在腋淋巴結無轉移組，1～3個腋淋巴結轉移組及≥4個腋淋巴結轉移組之間進行兩兩比較發現：隨著腋淋巴結轉移的數量增多CD55hig有明顯上升趨勢，即隨腋淋巴結轉移的數量增多乳腺癌類干細胞的數量也增多。而乳腺癌類干細胞的多少控制著乳腺癌的復發和轉移風險，因此認為，CD55hig的細胞比例與乳腺癌灶的轉移和病情的進展有關，該實驗中CD55hig的細胞比例的升高可以間接反映患者癌灶具有更強的向周圍侵襲性和轉移性，CD55hig的比例的升高間接反映患者術后的復發率和轉移風險增加。

乳腺癌腫瘤組織中C-erbB2(++～+++)組的CD55hig群細胞的比例較C-erbB2(-～+)組的CD55hig群細胞的比例有明顯上升，這與C-erbB2在乳腺癌組織中的表達具有相似性。HER-2/neu基因作為乳腺癌的一種判斷預后的獨立生物學指標，與乳腺癌的侵襲性有關，它的表達影響著乳腺癌的預后，目前研究顯示，HER-2/neu高表達的患者復發率高，生存率低［18］。而本試驗中CD55hig群細胞的比例升高意味著乳腺癌類干細胞的增加，預示著患者的腫瘤具有更強的惡性生長和轉移的傾向，而且由于腫瘤類干細胞本身具有免疫逃逸和躲避化療藥物殺傷的特性，CD55hig組織也像C-erbB2(+～+++)的乳腺腫瘤組織一樣對化療具有抵抗性。

通過上述試驗結論認為，檢測乳腺癌患者腫瘤中CD55hig的細胞比例可以測定出乳腺癌類干細胞的含量，對判斷乳腺癌患者的預后和病情的進展具有重要參考價值，即CD55hig的細胞比例升高可能預示著乳腺癌惡性程度高，預后差即具有高度轉移和復發風險的一個慎重預后指標。但乳腺癌類干細胞的標志物的認定目前尚未達成共識，故本試驗仍處于探索階段，有待于擴大樣本量且增加對比指標及對患者的長期隨訪以進一步證實。

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