阿托伐他汀對oxLDL誘導泡沫細胞Lkn-1表達的影響

巨名飛 崔春燕 李金萍 張愛文 侯瑞田

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應伴隨其發展始終［1］。炎性因子和炎性細胞間相互作用是AS發病機制的核心?？寡字委熥鳛橐环N有效的治療手段，越來越受到人們的重視。白細胞誘素-1(Lkn-1)是新發現的炎性因子，具有強烈趨化白細胞向炎癥損傷部位快速聚集，促使前炎性介質釋放和血栓形成的作用。國外有報道Lkn-1與AS的發生發展有著密切關系［2］。阿托伐他汀為，除具有調酯作用外，還具有抗炎、改善血管內皮功能、抗氧化、調節細胞增殖等作用，近年他汀抗炎作用越來越受心血管領域重視，在降低心血管事件發生率上起著重要作用［3，4］。本實驗以ox-LDL誘導的U937細胞形成的泡沫細胞為AS實驗模型，觀察阿托伐他汀對ox-LDL誘導U937細胞形成泡沫細胞過程中炎性因子Lkn-1表達的影響，進而研究其動脈粥樣硬化過程中的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 阿托伐他汀提取物輝瑞公司饋贈。佛波酯購自Sigma公司。鼠抗人Lkn-1抗體購自R＆D公司。RPMI-1640培養基和Trizol購自Gibco公司。M-MLV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP、Oligo(dT)購自 Promega公司。引物由上海生工合成。其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 氧化型低密度脂蛋白制備 低密度脂蛋白(LDL)的純化、氧化修飾及鑒定采集健康成人空腹12 h后新鮮混合靜脈血，加入100 mmol/L EDTA抗凝。采用超速離心法分離離心速度42 000 r/min獲得LDL提取液，經瓊脂糖電泳顯示為單一蛋白帶。將LDL置于含10μmol/L CuSO4的PBS溶液(pH值7.4)中，37℃溫育24 h。氧化后的LDL置含200μmol EDTA的PBS中透析24 h，PBS再透析24 h，過濾除菌后4℃保存。LDL中的脂過氧化物在氧化過程中增加，顏色也由逐漸變淺。瓊脂糖電泳顯示，OxLDL的電泳遷移速率快于未氧化的LDL。

1.3 U937細胞培養及誘導分化 人U937單核細胞株由吉林大學基礎免疫教研室饋贈。細胞懸浮樣生長于含10%高溫滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內培養。每2～3天換液1次。

1.4 實驗分組 每次實驗前用100 nmol/L佛波酯孵育U937單核細胞72 h，使其誘導分化為巨噬細胞，換無血清24孔培養板培養24 h后加處理因素。將細胞隨機分為5組，正常對照組(對照組):U937巨噬細胞置于無血清24孔培養板培養中。模型組(ox-LDL組):在U937巨噬細胞的培養液中加入ox-LDL 100 mg/L，阿托伐他汀低濃度組(AV1組):在培養的細胞中加入阿托伐他汀(0.1μmol/L)，然后加入ox-LDL 100 mg/L。阿托伐他汀中濃度組(AV2組):在培養的細胞中加入阿托伐他汀的濃度為1μmol/L。阿托伐他汀高濃度組(AV3):在培養的細胞中加入阿托伐他汀10μmol/L。各組設3復孔，于5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養24 h。

1.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測Lkn-1蛋白的表達 收集各組細胞上清液，包被:于96孔酶標板每孔中加各組上清100μl及0.01%碳酸鹽buffer(PH9.6)100μl，4℃過夜。棄上清，PBST緩沖液洗3次，5 min/次。加入封閉液(0.1%BSAPBS)100μl/孔，37℃ 30 min。棄上清，PBST緩沖液洗3次，5 min/次。加入一抗鼠抗人Lkn-1工作液(由鼠抗人Lkn-1貯存液按1∶100稀釋而成)100μl/孔，37℃ 2 h。棄上清，PBST緩沖液洗3次，5 min/次。加入抗兔的 HRP標記的二抗，100μl/孔，37℃ 2 h。棄上清，PBST緩沖液洗3次，5 min/次。顯色:加入顯色劑100μl/孔，37℃ 30 min;產物顏色逐漸由無色轉為橙黃色。加終止液50μl/孔，用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。測量:酶標儀測定OD 490 nm值，記錄結果。

1.6 逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測Lkn-1 mRNA的表達 收集對照組和實驗組細胞，TRIzol試劑提取細胞總RNA，溶于無Rnase水中，紫外分光光度計測定A260/A280的比值在1.8～2.0。分別取1μg RNA在20μl反應體系中逆轉錄合成cDNA;取5μl cDNA于50μl反應體系中進行PCR擴增Lkn-1引物，上游:5’-ATCCTACACCCCACGAAGCAT-3 ’，下游:5’-AATTCTTCCTGGTCTTGATCCG-3’(169bp)。內參GAPDH引物，上游:5’-ACCACAGGCCATGCCATCAC-3’，下游:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(450bp)。PCR產物經 2%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml溴化乙錠)3 V/cm電泳分離，對電泳條帶進行掃描定量分析并攝像，應用作為GAPDH內參照。Lkn-1 mRNA表達分析:采用Image Master VDS進行光密度掃描(IOD)，以各組Lkn-1條帶和相應GAPDH的條帶的IOD比值表示Lkn-1表達的強弱。

1.7 統計學分析 應用SPSS12.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U937單核細胞分化為巨噬細胞、泡沫細胞形態學改變光學顯微鏡下U937細胞呈圓形、懸浮狀態，經100 nmol/L PMA誘導分化后，細胞形態變為梭形、橢圓形或不規則形，由懸浮變為貼壁狀態，且伸展偽足，細胞體積增大，表明已經分化為巨噬細胞。再與100 mg/L ox-LDL孵育后油紅O染色可見細胞內含許多紅色脂類顆粒物質，提示AS泡沫細胞模型制備成功。

2.2 ELISA方法檢測Lkn-1蛋白的表達結果表明 正常狀態下，U937巨噬細胞可以表達少量的Lkn-1。ox-LDL組與C組比較Lkn-1表達明顯增加(P＜0.05)，應用不同濃度的阿托伐他汀干預后，與ox-LDL組相比較，Lkn-1的表達水平明顯下降(P＜0.05)。且隨阿托伐他汀濃度的增加，Lkn-1的表達呈逐漸下降趨勢。見表1。

表1 不同濃度的阿托伐他汀對Lkn-1蛋白表達的影響

2.3 RT-PCT檢測Lkn-1基因的結果 C組中Lkn-1條帶顏色較淺，ox-LDL作用U937MΦ24 h后條帶顏色明顯加深;加用不同濃度的阿托伐他汀后，Lkn-1條帶顏色比ox-LDL組變淺。ox-LDL組與C組比較Lkn-1表達明顯增加(P＜0.05)，這與ELISA結果基本一致。見表2。

表2 5組細胞上清液中Lkn-1與內參積分光密度比值

3 討論

動脈粥樣硬化是一種損傷性炎性反應疾病，在其形成與發展過程中有大量炎性因子的參與［5］。炎性因子在AS中的作用已受到廣大學者的重視。Lkn-1是新發現的由巨噬細胞分泌的CC趨化因子，受體為CCR1或CCR3［6］。功能與MCP-1功能相近，對人外周血中性白細胞、單核細胞和淋巴細胞具有強大的化學趨化性，參與炎癥免疫反應。此外，還可誘導其它炎癥因子的表達，促進血栓形成等作用。國外有報道Lkn-1和與動脈粥樣硬化的關系密切。它可以強烈趨化血液循環中的白細胞向炎癥部位聚集。而白細胞、單核細胞向血管內皮下遷移是AS早期最重要的始動環節。研究表明，在AS的早期病灶中已有Lkn-1的表達，而且這種表達受病理生理狀態、代謝產物、氧化應激等多因素的影響。

Ox-LDL是致AS的獨立危險因素，它可通過多重途徑參與動脈粥樣硬化的發生發展過程，ox-LDL引起內皮功能障礙，啟動AS始動環節［6］;趨化單核細胞并誘導泡沫細胞形成;誘導平滑肌細胞增殖和凋亡;促進粥樣斑塊的破裂和血栓形成;誘導自身抗體與其形成循環免疫復合物。不僅如此，它還可作為炎癥反應過程中潛在的誘導劑，正向調節AS中主要細胞表達一些炎性因子，如 C-反應蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6(IL-6)等［7］。由于生物連鎖反應，這些因子又可刺激炎細胞分泌更多炎癥因子，形成正反饋級聯放大炎癥反應，加速AS的發展，導致心血管不良事件的發生。本實驗中用濃度為100 mg/L的ox-LDL作用于培養的巨噬細胞24 h后發現ox-LDL組較對照組Lkn-1的表達明顯增加。進一步證明ox-LDL可發揮類似于前炎癥介質的作用，刺激炎性因子的表達。這是其致AS形成的重要機制之一。

Lkn-1是新發現的炎性細胞因子，在炎性反應中起著重要作用［8］，表現為趨化單核細胞遷移至內皮下，誘導其他炎性因子表達和分泌，加速血栓的形成。有研究表現:Lkn-1具有誘導炎細胞表達和分泌炎性因子的作用。Lee等［9］應用Lkn-1處理人單核細胞白血病(THP-1)細胞株15 min，即可上調與AS斑塊形成有關的炎癥因子IL-8、MCP-1和TNF-αmRNA的表達。這些細胞因子在AS的多個環節中分別發揮生物學效應，進一步激活炎細胞。這樣炎性介質與炎細胞之間形成一正反饋通路，級聯放大炎性反應，推進AS的發展。本實驗證明在泡沫細胞中有大量炎性因子Lkn-1表達，說明Lkn-1參與動脈粥樣硬化過程。

他汀類藥物可有效降低低密度脂蛋白水平，對炎性反應具有抑制作用，可減少巨噬細胞等炎性細胞因子表達。本研究用ox-LDL誘導U937細胞形成泡沫細胞，不同濃度阿托伐他汀干預后，與正常對照組相比，Lkn-1表達減少，且與阿托伐他汀的劑量有濃度依賴關系。阿托伐他汀可通過抑制ox-LDL誘導U937細胞形成泡沫細胞過程中Lkn-1的表達，發揮穩定粥樣斑塊和抗炎作用，其抗AS作用可能是通過抑制炎性因子的釋放，減輕炎性反應實現的，但其通過何種信號通路減少炎性因子的釋放還有待進一步研究。

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8 徐麗，凌文華.Leukotactin-1與動脈粥樣硬化.嶺南急診醫學雜志，2006，11:160-161.

9 Lee WH，Kim SH，Jeong EM，et al.A novel chemokine，Leukotactin-1，induces chemotaxis，pro-atherogenic cytokines，and tissue factor expression in atherosclerosis.Atherosclerosis，2002，161:255-260.