何首烏飲對快速老化小鼠性激素及其受體的影響

王超 陳泓強 李亞麗 張明明

隨著社會的發展，環境污染、職業競爭、生育年齡推遲等多種因素均加快了女性性腺衰老和性激素失衡，致使卵巢功能降低，導致了卵巢早衰、不孕、更年期提前等許多女性疾病的發生。我們的前期研究發現補腎方劑何首烏飲能對抗大鼠卵巢組織衰老［1］，本研究擬在前期的實驗基礎上，觀察何首烏飲對快速老化小鼠雌二醇(E2)、黃體生長激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平的影響及其受體表達的變化，探討何首烏飲延緩卵巢衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SAMP8小鼠，SPF級，60只，雌性，30～40 g;SAMP1小鼠，SPF級，12只，雌性，30～40 g;購自北京大學醫學部實驗動物科學部，動物許可證號:SCXK(京)2006-0008。

1.1.2 試劑與儀器:何首烏飲:何首烏(炙)、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓，用水提取成濃縮液。雌二醇(E2)、黃體生長激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)試劑盒購自德國羅氏診斷有限公司;雌激素受體 α(ERα)、LH受體(LHR)、FSH受體(FSHR)引物均由上海生工工程公司合成;ERα小鼠單克隆抗體、LHR、FSHR兔多克隆抗體均購自Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥:SAMP8小鼠，60只，隨機分為模型組、何首烏飲低劑量:10 g·kg-1、何首烏飲中劑量組:20 g·kg-1、何首烏飲高劑量組:40 g·kg-1、陽性藥維生素VE組:35 mg/kg，每組12只動物。另設SAMP1小鼠為對照組。何首烏飲和VE組每日分別灌胃何首烏飲和VE，連續8周，對照組和模型組灌胃給予蒸餾水。

1.2.2 血清指標檢測:采用陰道涂片法觀察小鼠動情期，在小鼠動情前期眼眶取血，離心，分離血清，全自動微粒子化學發光免疫分析方法檢測血清E2、LH、FSH含量。

1.2.3 卵巢指數的檢測:處死小鼠，取卵巢，稱重，計算卵巢指數=卵巢/體重×100%。

1.2.4 熒光定量PCR方法測定卵巢組織中ERα、LHR和FSHR mRNA的表達 取卵巢組織，Trizol一步法提取總RNA，鑒定完整性，進行逆轉錄反應，熒光定量PCR儀擴增，ERα引物為:上 游 5，-TCAACTGGGCAAAGAGAGTG-3，下 游 5，-GACGAGACCAATCATCAGAATC-3，長度為 104 bp;LHR引物為:上 游 5，-GGCTGGGATTACGATTATGAC-3，下 游 5，-AGGGATTGAAAGCATCTGGT-3，長度為76 bp;FSHR引物為:上游5，-GTCCTGATGAGCAAGTTTGG-3，下游 5，-AGGGATTCTTTCTGGAGTGG-3，長 度 為 100 bp;GAPDH 引 物 為:上 游 5，-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，下游 5，-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3，長度為120 bp。完成擴增后，以對照組為標準，以GAPDH為內參照基因，計算ERα、LHR、FSHR表達的相對定量值用于統計分析。

1.2.5 Western-blot方法測定卵巢組織中ERα、LHR、FSHR蛋白的表達取卵巢，加入細胞裂解液研磨，離心取上清，用蛋白定量測定試劑盒進行總蛋白測定。電泳分離蛋白，PVDF膜用脫脂奶粉常溫封閉，分別加入ERα、LHR、FSHR一抗(稀釋度1∶200～1∶500)，加入過氧化物酶標記的二抗(稀釋度 1∶1 000)，滴加酶的作用底物ECL，暗室中X線底片曝光，顯影，定影。將X膠片條帶掃描后輸入圖像分析系統，結果以與內參照基因GAPDH的比值表示，進行統計分析。

1.3 統計學分析應用SPSS11.5統計軟件，計量資料以±s表示，采用ANOVA分析處理和Dunnet t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 激素水平及卵巢指數的變化 模型組較對照組血清中E2、卵巢指數明顯下降(P＜0.01)，LH、FSH明顯上升(P ＜0.01);與模型組比較，VE組、何首烏飲組E2、卵巢指數均明顯上升(P ＜0.01)，FSH均明顯下降(P ＜0.01)，VE組、何首烏飲中、高劑組LH明顯下降(P＜0.01)。見表1。

表1 何首烏飲對SAMP8小鼠激素水平的影響±s

表1 何首烏飲對SAMP8小鼠激素水平的影響±s

注:與對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

組別 E2(pg/ml) LH(mU/ml) FSH(mU/ml) 卵巢指數(mg/100 g)52.12±10.15 2.58±0.32 1.33±0.32 43.12±5.77模型組 9.88±1.91* 21.54±4.12* 16.29±2.14* 24.98±3.68*VE組 21.34±3.69# 9.08±2.11# 10.30±2.78# 36.54±4.46#何首烏飲低劑組 17.81±2.17# 20.69±4.19 9.37±2.53# 34.11±6.67#何首烏飲中劑組 20.18±5.24# 8.91±1.25# 6.38±1.72# 40.14±5.42#何首烏飲高劑組 29.39±5.77# 4.03±0.59# 4.04±0.58# 41.13±5.85#對照組

2.2 卵巢組織中ERα、LHR、FSHR表達的變化 模型組較對照組卵巢組織中ERα、LHR、FSHR mRNA和蛋白表達均明顯下降(P＜0.01);與模型組比較，VE組、何首烏飲組ERα、LHR、FSHR mRNA和蛋白表達均明顯上升(P＜0.01)。見表2。

表2 何首烏飲對SAMP8小鼠卵巢ERα、LHR、FSHR表達的影響±s

表2 何首烏飲對SAMP8小鼠卵巢ERα、LHR、FSHR表達的影響±s

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

蛋白對照組 0.98±0.12 0.89±0.13 0.95±0.11 0.79±0.09 1.0組別 ERα mRNA 蛋白LHR mRNA 蛋白FSHR mRNA 4±0.14 0.88±0.13模型組 0.39±0.05* 0.33±0.04* 0.37±0.05* 0.28±0.04* 0.44±0.06* 0.36±0.05*VE組 0.64±0.12# 0.55±0.06# 0.55±0.07# 0.49±0.06# 0.62±0.07# 0.53±0.06#何首烏飲低劑組 0.47±0.05# 0.41±0.05# 0.38±0.05 0.31±0.04 0.47±0.06 0.39±0.05何首烏飲中劑組 0.69±0.08# 0.65±0.07# 0.59±0.06# 0.53±0.07# 0.61±0.09# 0.68±0.09#何首烏飲高劑組 0.71±0.12# 0.69±0.08# 0.69±0.09# 0.59±0.07# 0.68±0.11# 0.75±0.11#

3 討論

卵巢衰老是女性機體衰老的開始，因此卵巢衰老越來越被人們大量關注。臨床研究認為卵巢衰老開始的標志是FSH水平升高［2］，通常把女性FSH≥20 mU/ml作為卵巢功能低下的一個標準，之后的FSH、LH持續升高，E2持續降低，最后導致絕經的發生［3］。我們觀察到SAMP8快速老化小鼠血清中E2水平明顯降低，LH、FSH明顯上升，同時小鼠卵巢指數明顯下降，表明SAMP8小鼠出現了性激素水平異常，卵巢老萎縮。何首烏飲治療組能明顯降低LH、FSH水平，升高E2，升高卵巢指數，表明何首烏飲能夠調節生殖內分泌功能，直接作用于卵巢，延緩其衰退。

雌激素在女性機體中起著重要的作用，雌激素缺乏，不僅會對女性生殖功能影響巨大，而且會引起骨質疏松［4］、心血管病［5］等多種病癥。雌激素主要通過與其受體ER結合而發揮生物學作用，激素靶器官對激素的反應是通過循環中激素濃度和靶器官受體的含量二方面而決定的。已知ER分兩個亞型，即ERα、ERβ，兩類受體有著不同的功能，研究認為，ERα主要存在于卵囊泡膜細胞，可通過負反饋回路調節排卵［6］。我們觀察到SAMP8小鼠卵巢組織中ERαmRNA和蛋白表達明顯降低，而給予何首烏飲治療后ERαmRNA和蛋白均顯著升高，提示何首烏飲可以通過調節卵巢組織中的激素受體而發揮其調控內分泌的作用。

在生理狀態下，LH、FSH共同作用，調控卵巢各種性激素的合成與分泌，促進卵泡的正常生長發育，LH的主要作用是促進排卵和黃體形成，FSH的主要作用是促進卵泡成熟及分泌雌激素，但二者均需要與相應的受體結合而發揮生物效應［7］。其中，LHR存在于卵泡膜細胞和竇期卵泡的顆粒細胞，FSHR存在于竇前期卵泡和竇期卵泡的顆粒細胞。我們的結果顯示SAMP8快速老化小鼠卵巢中LHR、FSHR mRNA和蛋白表達均下降，何首烏飲能顯著提高LHR、FSHR mRNA和蛋白表達，提示何首烏飲可通過上調LHR、FSHR表達而起到促卵泡生長的作用。

我們的結果顯示何首烏飲能上調ERα、LHR、FSHR的表達而起到調節調控性激素，從而達到延緩快速老化小鼠卵巢衰老的作用，可能是何首烏飲防止衰老的作用機制之一。這一問題的闡述，有利于何首烏飲的臨床應用和推廣。

1 張娜，李亞麗，牛嗣云，等.中藥何首烏飲抗大鼠卵巢組織衰老的機理.解剖學報，2008，39:187-191.

2 Orvieto R，Meltcer S，Liberty G，et al.Does day-3 LH/FSH ratio influence in vitro fertilization outcome in PCOSpatients undergoing controlled ovarian hyperstimulation with different GnRH-analogue?Gynecol Endocrinol，2012，28:422-444.

3 胡立君，高鳳春.綜合療法對圍絕經期綜合征患者血清雌激素的影響.中國婦幼保健，2012，27:2994-2996.

4 Miller PD.A review of the efficacy and safety of denosumab in postmenopausal women with osteoporosis.Ther Adv Musculoskelet Dis，2011，3:271-282.

5 Manrique C，Lastra G，Habibi J，et al.Loss of Estrogen Receptorα Signaling Leads to Insulin Resistance and Obesity in Young and Adult Female Mice.Cardiorenal Med，2012，2:200-210.

6 Pastore MB，Jobe SO，Ramadoss J，et al.Estrogen receptor-α and estrogen receptor-βin the uterine vascular endothelium during pregnancy:functional implications for regulating uterine blood flow.Semin Reprod Med，2012，30:46-61.

7 付靈梅，譚朝陽，王麗君，等.紫石英對排卵障礙大鼠卵巢局部卵泡刺激素受體、黃體生成素受體表達的影響.中國實驗方劑學雜志，2011，17:184-186.