24個泥蚶EST-SSR標記的開發與分析

史松富, 姚韓韓, 林志華, 周小龍, 齊曉艷, 董迎輝

(1. 浙江萬里學院 浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗, 浙江 寧波 315100; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306; 3. 寧波大學 海洋學院, 寧波 315211)

微衛星標記又稱簡單重復序列(simple seque ncerepeat, SSR), 其核苷酸序列是以2～6個核苷酸為一個單位重復排列。微衛星因其在基因組中分布廣泛、多態性豐富、共顯性遺傳、重復性好以及實驗操作簡單等特點, 已被廣泛應用于遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種、遺傳連鎖圖構建、QTL定位以及物種親緣關系鑒定[1-3]。SSR標記的開發與分析在太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[4-5]、泥蚶(Tegillarca granosa)[6-7]、魁蚶(Scapharca brougtonii)[8]、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[9-10]、文蛤(Meretrixmeretrix)[11]等海洋雙殼貝類中已有報道。

泥蚶(Tegillarca granosa), 俗稱血蚶、花蚶、粒蚶,為我國四大海水養殖貝類之一。泥蚶肉質鮮美、營養豐富, 市場前景廣闊。關于泥蚶分子標記的研究已有很多報道, 如李太武等[12]利用RAPD標記技術分析了5個泥蚶群體的遺傳多樣性, 姚韓韓等[13]利用 AFLP標記技術對泥蚶4個快速生長家系的遺傳變異進行了分析, 顧曉英等[14]通過磁珠富集法篩選了6對多態性SSR引物; 董迎輝等[6]利用泥蚶轉錄組文庫開發了34個EST-SSR標記, Liu 等[7]開發了39個泥蚶EST-SSR位點。本研究在泥蚶轉錄組文庫的基礎之上, 探討利用單拷貝序列篩選SSR標記的可行性及優缺點, 為泥蚶的種質資源保護、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構建以及種群鑒定提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與DNA提取

實驗樣品采自浙江寧波奉化海區, 隨機取樣 30粒, 活體解剖后取其閉殼肌, 保存于-20℃冰箱中備用。采用酚-氯仿法提取基因組DNA, 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA的質量, 紫外分光光度計檢測DNA的純度與濃度, 調節DNA濃度最終為100 ng/μL。

1.2 候選SSR位點的獲得與引物設計

用SSR Hunter1.3軟件在單拷貝序列中篩選微衛星位點, 篩選標準為二堿基、三堿基、四堿基、五堿基重復單元重復至少依次為 6、4、3、3次, 側翼序列大于150 bp。利用軟件Primer5.0設計引物, 引物長度18～24 bp, GC含量40%～60%, 引物由上海生工合成(表 1)。

1.3 泥蚶候選SSR位點檢測與PCR擴增

隨機取6個泥蚶DNA混成基因池, 對所有引物進行初步篩選。PCR反應體系為20 μL, 包括100 ng DNA, 0.2 mmol/L dNTP, 0.5U Taq 酶, 10×PCR buffer, 上游引物與下游引物各1 μmol/L, 1.5 mmol/L MgCl2。PCR反應條件: 94℃變性5 min; 94℃變性45 s,退火45 s, 72℃ 45 s, 共35循環; 72℃延伸8 min; 4℃保存。每對引物所需的退火溫度見表1。用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物,電泳緩沖液為 1×TBE, 電壓為 180 V, 電泳時間為3～4 h, EB染色, 用Biorad 凝膠成像系統檢測結果。

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1.4 泥蚶SSR位點分析

利用篩選的引物對泥蚶30個個體進行微衛星標記的多態性檢測, 用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物。用CERVUS 3.0軟件處理結果, 獲得重要的遺傳學參數: 等位基因數(Na)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)和多態信息含量(PIC)。用在線軟件 GENEPOP進行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢測, 利用 Bonferroni correction法對結果進行校正。

2 結果

2.1 泥蚶SSR位點的篩選

利用SSR Hunter1.3軟件搜索3000條單拷貝序列(singleton), 獲得132條含有SSR位點的序列, 成功設計引物有 50條, 成功率為 37.88%; 利用 Primer5.0在各SSR位點兩側保守區設計引物, 41對引物獲得穩定清晰的條帶; 在泥蚶群體中對41對引物進行多態性檢測, 24對引物的擴增產物表現為多態性。

在24個EST-SSR位點中, 三堿基重復類型的最多為18個, 占總SSR的75%; 其次二堿基重復類型的SSR有4個, 占總數的16.67%; 四堿基與五堿基重復類型的 SSR最少均為 1個, 均占總多態位點的4.17%(圖 1)。

圖1 泥蚶24個EST-SSR位點的核苷酸重復堿基的分布特征Fig. 1 Distribution of 24 EST-SSR motifs types in Tegillarca granosa

2.2 24個SSR位點對泥蚶群體的多態性評價

24個多態性位點在泥蚶 30個個體中共獲得 84個等位基因, 多態位點的等位基因數為2～5個, 平均等位基因數為 3.5 個, 其中 Tg02、Tg03、Tg08、Tg16、Tg19、Tg23六個位點的等位基因數為5個。觀測雜合度、期望雜合度分別為 0.000～0.591、0.045～0.727(表1)。PIC值是衡量群體變異程度的重要參數[15], 24個多態位點的PIC值介于0.043～0.696,平均值為 0.391, 其中有 11個高度多態位點(PIC＞0.5)、 4個中度多態位點(0.25＜PIC＜0.5)、9個低度多態位點(PIC＜0.25)。各多態位點經哈迪-溫伯格平衡檢測, 并用 Bonferroni correction法進行校正, 除Tg10、Tg11、Tg12、Tg17、Tg18、Tg21、Tg24 之外, 其余位點均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

3 討論

目前SSR開發主要是基于構建的基因組文庫和EST文庫, EST-SSR的開發具有操作簡單、成本低、高效率等特點, 越來越受到研究者的青睞。在海洋貝類中, 利用EST文庫篩選SSR的研究已較深入, 如Wang等[16]利用從文蛤EST文庫篩選出2970個候選SSR位點; Hou等[17]通過蝦夷扇貝轉錄組文庫得到2700個SSR候選位點。本研究在泥蚶轉錄組的單拷貝序列(singleton)中篩選SSR位點, 并將相關信息與從重疊群(contig)中篩選SSR位點的研究相比較, 分析singleton與contig篩選SSR位點的差異。

本研究利用泥蚶singleton篩選的SSR引物設計成功率為 37.88%, 董迎輝等[6]利用泥蚶 contig篩選SSR位點的引物設計成功率 73.97%, 引物設計成功率較低的原因有: (1)singleton的序列長度較短, 泥蚶singleton的平均長度為285.46 bp[18], 用于設計引物的區域相對較小, 而contig的平均長度為964.2 bp。(2)singleton中的一小部分被認為是在測序過程中被其他生物的序列污染或者是人工序列的產生[17]。

singleton來源的SSR同contig來源的SSR一樣能反映生物群體的重要遺傳學信息, 單拷貝序列的充分利用有利于群體的遺傳多樣性分析、種質資源的保護等, 如董迎輝等[6]利用 contig篩選 34個EST-SSR的研究中平均等位基因數為 3.59、平均多態信息含量為 0.396、平均期望雜合度為 0.447, Liu等[7]關于39個EST-SSR的研究中平均等位基因數、平均多態信息含量、平均期望雜合度分別為 3.9、0.402、0.449, 本實驗利用singleton篩選的24個SSR多態位點的平均等位基因數為3.5、平均多態信息含量0.391、平均期望雜合度0.434。 目前EST-SSR篩選主要來自contig, 而關于singleton的開發應用以及與contig的比較研究較少。本研究證實利用singleton開發SSR標記是可行的, singleton在轉錄組文庫中所占的比例較大且包含豐富的遺傳信息, 特別在表達豐度較低基因的開發方面較 contig具有更重要的應用價值[17]。

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