TOX和SMAD3基因多態性與中國漢族人群2型糖尿病患者微血管病變的易感性相關

呂 佳，蔡春友，魏鳳江，張 紅，林靜娜，韓鴻玲，陳莉明，李衛東

（1.天津醫科大學基礎醫學研究中心，天津300070；2.天津醫科大學眼科醫院，天津300384；3.天津市人民醫院，天津300121；4.天津醫科大學總醫院，天津300052；5.天津醫科大學代謝病醫院，天津300070）

糖尿病微血管病變（microvascular complications of diabetes,MVCD）主要包括糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）和糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy,DR），是糖尿病最常見的并發癥，其致死率和致盲率呈逐年上升的趨勢。先前的研究證實，糖尿病病程的長短和血糖的控制情況是MVCD發病的危險因素[1-2]，然而，有些患者MVCD的發生與血糖控制的程度并不相關[3]。另外有大量的研究表明MVCD在不同種族中患病率具有明顯的差異，而且其家族聚集現象也很明顯，這些都提示遺傳因素在MVCD的發生發展中起重要作用[4]。本研究以1 090名久居于天津地區的中國漢族2型糖尿病患者為研究對象，選取MVCD候選基因的SNP位點進行基因分型，旨在探討在中國漢族人群2型糖尿病患者中MVCD的遺傳背景和風險基因。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究共收集了1 090名天津地區的2型糖尿病患者，均為漢族，相互之間沒有血緣關系，其中男性571人，女性519人，年齡在23～87歲之間，平均為（60.75±11.11）歲，患者均參照2010年美國糖尿病協會公布的糖尿病診斷標準確診[5]。其中DN患者共615人（DN診斷標準為:有糖尿病史且微白蛋白/肌酐>300mg/g，除外原發腎小球病和其他繼發腎小球疾病）。非DN糖尿病患者475人；非增殖性糖尿病視網膜病變患者（DR）共290人，增殖性糖尿病視網膜病變（PDR）患者共87人，非DR糖尿病患者713人；同時罹患DN和DR的糖尿病患者共157人；糖尿病病程超過10年，非DN非DR患者共165人。糖尿病視網膜病變患者均經眼底鏡或眼底照相檢查，經天津醫科大學眼科醫院兩名專家確診。調查和取樣均征得受試者本人同意并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用高鹽法（原平皓公司試劑盒）用來提取外周血白細胞基因組DNA，應用Nanodrop 2000/2000c分光光度計測定樣品濃度及其在230 nm、260 nm及280 nm波長處的光密度（OD）值，記錄樣品濃度（μg/μL）和純度后置于-80℃保存備用。

1.2.2 候選基因及SNP的選擇 此次研究的候選基因一部分來自于2007年對2型糖尿病全基因組關聯研究（genome-wide association study,GWAS）的結果[6-7]，以及先前本實驗室對糖尿病、肥胖候選基因SNP位點基因分型（genotyping）的結果（李衛東等，待發表資料），另一部分來自于以往的相關報道和MVCD發生有關的生物學途徑。依據SNP數據庫（The Single Nucleotide Polymorphism Database，db-SNP）中每個基因SNP位點的連鎖不平衡狀態和中國漢族人群的等位基因頻率，選擇了與糖尿病微血管病變有關的14個基因的23個SNP位點，并對這些SNP位點進行基因分型（表1）。

1.2.3 基因分型 1 090例2型糖尿病患者基因分型由IlluminaSNP芯片技術平臺進行。在進行基因分型時設重復對照，以便對基因分型結果進行監測和質量控制。基因分型的結果錄入Filemaker Pro數據庫中。

1.3 數據分析 數據分析應用PLINK軟件對病例對照樣品進行二分變量的關聯分析，PLINK比較病例和對照組等位基因頻率，進行Chi方檢驗。在對照組的選擇上，我們采取兩種方案：（1）采用某種疾病(DN,DR,PDR和MVCD)的所有非患病個體作為對照；（2）以2型糖尿病病程超過10年，非DN非DR者作為對照 （n=165）。因為此次進行基因分型的SNP位點較少，并且相同基因SNP位點間存在連鎖不平衡，所以未對二分變量關聯分析進行多重檢驗的調整。

表1 糖尿病微血管病變候選基因SNP位點選擇Tab1 SNP selection ofMVCD candidategenes

2 結果

在1 090例糖尿病患者中，針對DN、DR、PDR和MVCD，對候選基因SNP位點進行了病例-對照的二分變量關聯分析，結果見表2、表3。

以病程大于10年，無DN無DR糖尿病患者為對照，得到的關聯更加顯著：發現TOX基因的rs1526167位 點 與 DN（P=0.002，OR=0.60）、DR（P=0.011，OR=0.635）、PDR（P=0.044，OR=0.587）和MVCD（P=0.001，OR=0.596） 均存在顯著關聯，SMAD3基因的 rs12102171位點與 DN（P=0.042，OR=1.453）、DR（P=0.010，OR=1.656）、PDR（P=0.017，OR=1.947）和 MVCD（P=0.024，OR=1.507）均存在顯著關聯。而另一些基因（IGF2BP2、CDKAL1、ESR1）SNP位點則與DN或PDR有關聯（表2）。

表2 候選基因SNP位點與糖尿病微血管病變的關聯分析（P值）Tab2 Association analyses for candidategene SNPs and diabeticm icrovascular complications(P values)

表3 TOX和SMAD3基因SNP位點與糖尿病微血管病變的關聯分析Tab3 Associationsam ong TOX,SMAD3 gene SNPsand diabeticm icrovascu lar comp lications

3 討論

MVCD是糖尿病最常見的并發癥，是導致慢性腎功能不全和非外傷性致盲的主要原因，嚴重危害著糖尿病患者的健康。由于MVCD在不同人種中的患病率差異和明顯的家族聚集現象，人們對基因在MVCD發病中的作用日益重視。目前已有許多關于MVCD易感基因的研究報道，這些基因可以分為7類，分別是 VEGF[8]、EPO[9]、ACE[10]、IL1RN、PON1[11]、SOD2[12]和HFE，這些基因及其作用與糖尿病相關基因并不完全相同，表明MVCD遺傳性可能獨立于糖尿病自身的遺傳性。

此次研究采用大樣本、多基因的研究方法，探討MVCD在2型糖尿病患者中的易感基因，以揭示MVCD的遺傳背景。本實驗共收集了1 090名2型糖尿病患者，按照MVCD患病情況進行分組（DN、DR、PDR、MVCD），采用病例對照的方法進行二分變量的關聯分析。以往的MVCD遺傳學研究，均以健康人群為對照，忽略了血糖、病程等因素對實驗的影響。因此本次研究對照組選取165名病程大于10年非DR非DN的糖尿病患者，盡量避免上述因素對實驗造成的影響。從結果可以看出，如果以病程大于10年非DR非DN的糖尿病患者作為對照，盡管對照組人數較少(n=165)，但SMAD3、TOX基因SNP位點與DN、DR、PDR、MVCD的關聯更加顯著，提示SMAD3、TOX基因是MVCD的易感基因，且MVCD的遺傳背景與糖尿的遺傳背景不同。應當指出，有些2型糖尿病患者雖未發現微血管病變，但其已具備發生MVCD的遺傳學基礎，只是病程較短尚未發病，以這部分人作為對照來尋找MVCD的易感基因顯然值得商榷。我們采用病程>10年非DN非DR的T2D患者作為對照，可有效地檢出與MVCD相關(而不是與T2D有關)的基因，誠然，本實驗這部分對照的人數尚少，在一定程度上影響了檢驗效能（power）。

目前對MVCD發病機制的研究已經深入到了細胞因子信號轉導通路的層面，其中TGF-β/Smad信號轉導通路在MVCD發生和發展中的作用（特別是與器官纖維化的關系）已經得到了肯定[13]。SMAD3作為細胞膜受體和靶基因之間的關鍵橋梁，在TGF-β信號通路中發揮了核心作用，是TGF-β信號轉導通路中不可或缺的重要介質[14]。SMAD3基因具有多個SNP位點，這次我們選取rs1498506和rs12102171兩個位點。從本研究的PLINK結果中可以看出，SMAD3基因的 rs12102171與 DN、DR、PDR、MVCD均相關，與以往的研究結果相一致。

大量的研究表明，肥胖（尤其是內臟型肥胖）是產生胰島素抵抗的重要因素，而胰島素抵抗又是2型糖尿病發生的基礎。在先前的研究中發現TOX基因與肥胖相關，這就提示我們TOX基因可能是MVCD的易感基因。TOX基因是位于人類第8號染色體上的蛋白質編碼基因。在此次研究中發現，該基因的 rs1526167位點與 DN、DR、PDR、MVCD均有相關性。本研究為進一步了解和探討MVCD的遺傳背景提供了有意義的線索，但由于MVCD的發生發展是多種遺傳因素和環境因素的共同作用所決定的，所以還需進一步進行更大樣本量的、全基因組水平的研究。

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