RP－HPLC法測定人血草中黃連堿和白屈菜紅堿的含量

徐 幫 郭玲芝 程 凡 汪鋆植 鄒 坤

（天然產物研究與利用湖北省重點實驗室（三峽大學），湖北 宜昌 443002）

人血草Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde是罌粟科金罌粟屬植物，又名豆葉七，人血七、野人血草、大金盆.產湖北西部、陜西南部和四川東部.以全草入藥，有活血、調經、舒筋、散淤、止痛等功效，用于月經不調，跌打損傷［1－2］.人血草作為民間藥在湖北省及周邊民間應用歷史悠久，范圍廣范.本實驗室前期對人血草藥材的顯微特征、理化鑒別、水分、總灰分、酸溶性浸出物、醇溶性浸出物進行了相關質量標準的研究［3］.研究表明，人血草的主要化學成分為四氫黃連堿、血根堿、白屈菜紅堿、黃連堿別隱品堿、原阿片堿等生物堿類化合物.其中黃連堿和白屈菜紅堿的含量較大，且為其主要的生理活性成分［4－5］.本文采用高效液相色譜法，對人血草藥材中黃連堿和白屈菜紅堿進行了含量測定，通過試驗分析，結果表明該方法簡單、準確、重現性好，可作為質量控制的方法.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Varian210分析型高效液相色譜系統210型二元梯度泵，210型紫外檢測器，美國 Varian公司；ME215S型1／10萬電子天平，德國Sartorius公司；S－3100紫外分光光度計，韓國Sinco公司；旋轉蒸發儀，日本EYELA.

1.2 試劑與試藥

黃連堿和白屈菜紅堿均為本實驗室自人血草中分離并鑒定，以HPLC面積歸一法測定其純度數大于98%；甲醇和乙腈為色譜純，水為高純水，其它試劑均為分析純.人血草全草分別采集自中國湖北省神農架、五峰、長陽，經本實驗室楊進副教授鑒定為Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde.原植物及藥材標本現保存于天然產物研究與利用湖北省重點實驗室（三峽大學）.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

YMC－Pack ODS－AA色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流速1.0mL·min－1；檢測波長280nm；進樣量20μL；柱溫30℃；流動相為乙腈（B）－水相（0.2%磷酸＋0.2%三乙胺）（A）梯度洗脫，0～1min，20%B，80%A；1～10min，40%B，60%A；10～20min，50%B，50%A；20～30min，100%B.

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取對照品黃連堿6.62mg和白屈菜紅堿3.18mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品貯備液.以0.22μm微孔濾膜過濾，低溫避光保藏備用.

2.2.2 供試品溶液的制備

取人血草藥材粉末（過40目篩，50℃烘干）約3.0 g，精密稱定，置于250mL圓底燒瓶中，加入6倍量的95%乙醇溶液，加熱回流2次，每次60min，收集醇溶液，蒸干，殘渣用50mL三蒸水溶解，用0.1mol·L－1磷酸調pH至3～4，靜置過夜，過濾，用0.1mol·L－1氫氧化鈉溶液調pH至7～8，用等量氯仿萃取3次，收集氯仿液，回收氯仿，殘渣用甲醇溶解于5mL容量瓶中，搖勻，定容，得供試品溶液.以0.22μm微孔濾膜過濾，低溫避光保藏備用.

對照品以及供試品的色譜圖如圖1所示.

圖1 對照品和供試品的HPLC圖

2.3 線性關系試驗

分別吸取對照品貯備液0.2，0.4，0.6，1，2，4mL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1項下色譜條件測定，各進樣20μL，以色譜峰面積（Y）為縱坐標，以黃連堿和白屈菜紅堿的濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸.黃連堿和白屈菜紅堿的回歸方程分別為:

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品貯備液6份，按2.1項下色譜條件連續進樣，進樣量20μL，每個濃度進樣3次，測定黃連堿和白屈菜紅堿的色譜峰面積，計算RSD（n＝6）分別為1.8%，1.6%.

2.5 重復性試驗

取人血草藥材粉末5份，每份約3.0g，精密稱定.按2.2.2項下方法平行制備，按2.1項下色譜條件進行分析，測定黃連堿和白屈菜紅堿的色譜峰面積，計算RSD（n＝5）分別為2.5%，2.3%.

2.6 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液20μL，分別于0，4，12，24，36，48h進樣分析，測定黃連堿和白屈菜紅堿的色譜峰面積，計算 RSD（n＝6）分別為1.3%，1.2%，結果表明48h內供試品溶液穩定性良好.

2.7 回收率試驗

取已知含量的樣品6份，每份約2.0g，精密稱定.各樣品分別加入對照品貯備液適量，按2.2.2項下方法平行制備，按2.1項下色譜條件，分別進樣20 μL進行測定.計算回收率結果見表1.

表1 黃連堿和白屈菜紅堿加樣回收率（n＝6）

2.8 樣品測定

取不同產地的人血草藥材各3份，每份約3.0g，精密稱定，按2.2.2項下方法平行制備，按2.1項下色譜條件進樣分析測定，根據標準曲線計算樣品中黃連堿和白屈菜紅堿的質量分數.結果見表2和表3.

表2 不同產地人血草樣品中黃連堿質量分數

表3 不同產地人血草樣品中白屈菜紅堿質量分數

3 討 論

為了能在適宜的分析時間內獲得指標成份的完全分離，在實驗中對流動相體系進行了反復摸索，分別用甲醇－水、乙腈－水、乙腈－醋酸水、乙腈－磷酸水、乙腈－三乙胺水、乙腈－磷酸－三乙胺水等體系進行洗脫，發現甲醇－水洗脫基線不平穩，分離度差，乙腈－醋酸水、乙腈－磷酸水和乙腈－三乙胺水的分離效果同乙腈－水體系的分離效果相比并沒有進一步改善，而以乙腈－磷酸－三乙胺水為最佳，黃連堿和白屈菜紅堿的峰形較好，分離度較高.本實驗采用的供試品溶液為氯仿萃取的粗提液，為保護色譜柱選用流動相梯度洗脫，可將強保留物質洗脫下來.

氯仿萃取之前的pH為7～8，若溶液pH過高，堿性太強容易產生乳化現象，對生物堿的提取不利.

本試驗同時測定黃連堿和白屈菜紅堿，在選定的色譜條件下，方法的精密度及重復性良好，穩定性強，準確度高，故可作為人血草藥材質量控制的標準.

［1］中國科學院中國植物編輯委員會.中國植物志:第32卷［M］.北京:科學出版社，1999.

［2］方志先，廖朝林.湖北恩施藥用植物志（上）［M］.武漢:湖北科學出版社，2006:383.

［3］朱靖靜，楊 進，鄒 坤，等.人血草質量標準研究［J］.中國民族民間醫藥，2009，15:22－24.

［4］Slavik J，Hanus V，Slavikova L.Alkaloids of the paraveraceae.91.Alokaloids from Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde［J］.Collection of Czechoslovak Chemical Communications，1991，56（5）:1116－1122.

［5］中華本草編委會.中華本草:第9卷［M］.上海:上海科學技術出版社，1999:672.