雜草對乙酰乳酸合成酶抑制劑類 除草劑抗藥性的研究進展

張云月， 盧宗志， 李洪鑫， 崔海蘭

(1.吉林省農業科學院植物保護研究所，吉林公主嶺 136100； 2.中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193)

雜草對乙酰乳酸合成酶抑制劑類 除草劑抗藥性的研究進展

張云月1， 盧宗志1， 李洪鑫1， 崔海蘭2

(1.吉林省農業科學院植物保護研究所，吉林公主嶺 136100； 2.中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193)

本文針對雜草對乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類除草劑抗藥性的產生歷史與發展現狀、抗藥性機理以及抗性基因的利用進行了綜述，并討論了該類除草劑在我國應用過程中應該注意的問題以及今后的發展方向。

雜草；乙酰乳酸合成酶；抗藥性機制

農田雜草是導致農作物減產的最主要原因之一，而施用化學除草劑是人們公認的防除農田雜草最有效、最經濟的手段。乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類除草劑因具有生物活性高、使用量低、殺草譜廣、選擇性強、對哺乳動物毒性低等優點而受到人們的青睞。但是由于該類除草劑作用位點單一，雜草極易對其產生抗藥性，因此抗ALS抑制劑類除草劑的生物型雜草成為發展速度最快的抗性雜草。抗性雜草問題的日益突出已經引起科學家們的極大關注，有關雜草對ALS抑制劑類除草劑抗藥性的研究已有很多報道。本文對近年來國內外學者對抗ALS抑制劑雜草的發展現狀、抗藥性機理及抗性基因的利用等方面進行了論述。

1 ALS抑制劑的作用原理

ALS是催化支鏈氨基酸——纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物合成過程中第一階段的關鍵酶[1-2]，它能夠在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化2個分子的丙酮酸生成α-乙酰乳酸和CO2，在異亮氨酸的合成中催化1個分子的丙酮酸與1個分子的α-丁酮酸生成 2-乙醛基-2-羥基丁酸和CO2[3]。ALS抑制劑類除草劑通過抑制植物體內ALS酶的活性來阻斷支鏈氨基酸的生物合成，進而影響蛋白質的合成并抑制細胞分裂，從而導致植物組織失綠、黃化，使植物的生長發育受到抑制而逐漸死亡，最終達到化學除草的目的。目前在全球范圍內應用比較廣泛的ALS抑制劑類除草劑主要有磺酰脲類(sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮類(imidazolinones，IMI)、 磺酰胺羰基三唑啉酮類(sulfonylamino carbonyl triazolinones，SCT)、三唑嘧啶類(triazolopyrimidines，TP)、嘧啶硫代苯甲酸酯類(pyrimidinylthiobenzoates，PTB) 等[4]。

2 抗ALS抑制劑類除草劑雜草的產生與發展現狀

美國杜邦公司于1982年成功研制出第一類ALS抑制劑類除草劑——磺酰脲類除草劑，自此其便開始大規模的商業化生產和應用。1987年，Mallory-Smith等報道毒萵苣對磺酰脲類除草劑產生了抗藥性[5-6]，這是第一例關于抗ALS抑制劑類除草劑雜草的相關報道，從此抗ALS抑制劑類除草劑的雜草生物型迅速發展，截至2013年3月，國際抗除草劑雜草委員會就報道已有34個國家和地區的129種雜草對一種或多種ALS抑制劑類除草劑存在抗藥性，涉及禾本科、十字花科、菊科、藜科、莧科、蓼科、莎草科、石竹科、千屈菜科、澤瀉科、旋花科、雨久花科等植物[7]。目前，在我國發現稻田中的雨久花(Monochoriakorsakowii)、慈姑(Sagittariasagittifolia)對芐嘧磺隆和吡嘧磺隆具有抗藥性[8-10]，小麥田的豬殃殃(Galiumaparine)[11]和播娘蒿(Descurainiasophia)[12-13]對苯磺隆產生了抗藥性。

3 雜草對ALS抑制劑的抗藥性機制

雜草對 ALS抑制劑類除草劑的抗性機理主要包括2種：第一種是基于代謝解毒能力的提高而產生的非靶標抗性；第二種是由于作用的靶標基因發生點突變或者靶標基因的過度表達而產生的靶標抗性。

3.1 基于解毒代謝功能增強的非靶標抗性

Cotterman等研究發現，抗禾草靈的瑞士黑麥草對氯磺隆具有交互抗藥性，原因可能是由于氯磺隆在植物體內形成的羥基氯磺隆(hydroxyl chlorsulfuron)與葡萄糖共軛結合的能力增強，使得植物體把氯磺隆轉化為無毒化合物的代謝能力有所提高[14]。鼠尾看麥娘對氯磺隆產生抗藥性則是通過N-脫烴作用和細胞色素P450有聯系的環形烷基氧化過程，使除草劑迅速降解而實現的[15]。稻稗對雙草醚產生抗藥性也是由于細胞色素P450的單加氧酶作用而引起的代謝加速所造成的[16]。耐藥大豆體內快速降解氯嘧磺隆的主要代謝途徑是與同源谷胱甘肽的綴合，其次是脫酯作用，2種代謝都能使ALS完全失去活性[17]。Devine認為，在除草劑的選擇壓力下，除草劑代謝涉及的主要代謝解毒酶類如谷胱甘肽還原酶、過氧化物歧化酶、細胞色素P450單加氧酶等含量和活性的提高都會使除草劑代謝為無毒化合物的能力加強，但是一般很難形成較高的抗性[18]。

3.2 靶標抗性

3.2.1 除草劑作用位點的改變 雖然有些雜草的抗性生物型是由于對除草劑解毒代謝能力的提高而產生的，但是在多數情況下，靶標酶基因發生點突變才是雜草產生抗性的主要原因。如ALS基因保守區中一個或者幾個位點發生突變，會使ALS分子結構發生改變，從而導致靶標酶對ALS抑制劑的敏感性降低[19-22]。目前在抗ALS抑制劑類除草劑的雜草生物型中，多數都是由6個氨基酸中的一個或幾個被取代所造成的：122位的丙氨酸被酪氨酸、纈氨酸或蘇氨酸所取代[23-24]；197位的脯氨酸被組氨酸、蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺所取代[25-27]；205位的丙氨酸被纈氨酸所取代[28]；376位的天冬氨酸被谷氨酸所取代[29]；574位的色氨酸被亮氨酸所取代[30]；653位的絲氨酸被蘇氨酸、天冬酰胺或異亮氨酸所取代[31]。這些發生突變的抗性位點都位于ALS催化亞基的保守功能域上。近年來的研究中還發現了一些新的突變位點，Sales等在研究稻田雜草紅稻對咪唑乙煙酸的抗藥性時發現了2個新的突變位點[32]，即Gly654突變成Glu654，Val669突變成Met669，并認為這2個位點的突變是紅稻對咪唑乙煙酸產生抗藥性的主要原因；Laplante等發現了5個狗尾草(Setariaviridis)抗性種群對咪唑啉酮均具有高的抗性，其中Brodhagen種群ALS的Gly654被Asp取代[31]；Massa等經過研究認為，風翦股穎(Aperaspica-venti)對SU、TP、SCT具有交互抗性是由于ALS基因中的Arg377突變成His所造成的[27]。

目前關于靶標位點氨基酸突變而產生雜草抗藥性方面的報道較多，而且這些抗性能夠穩定遺傳，其抗性基因在克隆并導入擬南芥之后，仍然具有抗性[33]。在除草劑的選擇下，雜草對ALS抑制劑類除草劑抗藥性的遺傳是由一個單一的、半顯性或者顯性的、核編碼的等位基因所控制的，其遺傳方式遵循孟德爾遺傳規律，且該抗性基因可以通過花粉和種子進行傳播[34]。

3.2.2ALS基因的過度表達 Xiao等篩選出了一個毛曼陀羅(DaturainnoxiaMill.)的抗氯磺隆生物型，經研究發現，這一生物型產生抗藥性的原因是靶標酶ALS的過量表達[35]。此外，在玉米自交系中也發現了由該種機制引起的對ALS抑制劑類除草劑的抗性[36]。Boutsalis等認為，東方大蒜芥(Sisymbriumorientale)NS01種群產生抗藥性不僅僅是由于ALS基因中的Trp574被Leu574替換而造成的，ALS酶的過量表達也可能引起該種群對ALS抑制劑產生抗性[22]。由于ALS基因的過度表達而產生抗藥性的生物型較少，目前對這一方面的相關報道也較少。

3.3 交互抗性

不同結構的ALS抑制劑往往能夠導致不同位置的氨基酸發生突變，從而對不同類別的ALS抑制劑類除草劑產生交互抗性。而抗藥性程度和范圍則取決于ALS上的氨基酸取代位點及種類[37]。目前報道最多的突變位點是Pro197，共有8種取代的氨基酸，是取代種類最多樣的一個位點，Pro突變成這8種氨基酸中的任何一種都會使雜草對SU類除草劑產生很高的抗藥性，而只有當Pro197被Leu取代時，雜草才會對IMI類抑制劑表現抗藥性[38]，原因可能是由于Pro197位于ALS酶活性位點通道入口α螺旋的一端，它可以同SU類抑制劑的芳香環結合，而與IMI類抑制劑咪唑喹啉酸無直接作用，咪唑喹啉酸只結合在活性位點通道的中間位置，因此Pro197只有被分子結構較大的氨基酸殘基取代才能阻礙IMI類抑制劑進入酶的活性部位。Ala122被Thr取代，Ser653被Asn、Thr取代均可使雜草對IMI類抑制劑產生很強的抗性，但對SU類抑制劑的抗性并不強；Ala122與二氫咪唑啉酮環有疏水銜接，如果替換為極性較大的氨基酸，除草劑就很難與ALS 的活性位點結合；對于SU類抑制劑，Ala122只與氯嘧磺隆結構中的乙酯取代基相互作用，而不與其他SU類抑制劑的乙酯取代基作用。當分子結構較大的氨基酸取代Ser653時，它占據了芳香環所在的空間，因此削弱了IMI類除草劑與 ALS的親和能力。Trp574殘基決定著ALS酶活性位點通道的形狀，并且在SU類和IMI類抑制劑與酶的結合中起著重要作用，因此該位點發生突變能夠使雜草對SU類和IMI類抑制劑均產生抗性[39]。

4 抗性基因的利用

隨著植物分子生物學研究領域的展開以及雜草對除草劑抗藥性機制研究的不斷深入，抗除草劑轉基因作物的研發和產業化得到了進一步深入。人們從由于基因突變而從對除草劑產生抗性的生物體中分離或者克隆出ALS抗性等位基因，將該基因導入植物受體細胞并整合進植物基因組中，從而獲得轉基因抗除草劑植物。將來自擬南芥或者煙草中發生點突變的ALS抗性等位點進行遺傳轉化，獲得了抗ALS抑制劑的轉基因玉米、小麥、水稻、油菜、向日葵、菊苣、甜菜、棉花、亞麻等作物新品種[40-42]，但是目前只有抗磺酰脲類除草劑的轉基因棉花和亞麻進入了商品化種植階段，其他品種尚處于研究階段[21]。此外，人們還通過誘變和組織培養的方式培育出了抗咪唑啉酮玉米、油菜和甜菜[43]。

5 結語

抗ALS抑制劑雜草生物型的產生及其迅速發展已經嚴重威脅了該類除草劑的正常使用和生產，同時也向當今過分依賴化學除草劑的雜草治理方式提出了嚴峻的挑戰。隨著科學技術的進步和科研手段的創新，雜草抗藥性機制的研究已經從生理生化和分子水平上揭示了除草劑與作用位點結合的關系以及由于位點突變而產生抗藥性的分子機制。我國對雜草抗藥性機制的研究起步較晚，與發達國家相比較為滯后，特別是對由于靶標酶基因發生突變而引起抗藥性雜草的相關報道相對較少，而對抗藥性雜草分子機制的研究又尤為重要。因此在抗藥性雜草研究方面，我國應該針對當前的雜草抗藥性發展現狀，合理借鑒國外的先進理念和技術，從分子生物學角度深入研究雜草產生抗藥性的原因，剖析靶標酶內部的基因變化，明確基因突變的發生位點，為抗藥性育種提供良好的種質資源及基因資源，同時也為除草劑分子設計與發展提供更廣闊的空間，并對如何科學地使用和保護該類除草劑以治理抗性雜草，以及開發新型抑制劑類除草劑提供理論基礎，從而建立一套可持續發展的雜草管理方案。

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ResearchProgressonWeedResistancetoAcetolactateSynthaseInhibitors

ZHANG Yun-yue1， LU Zong-zhi1， LI Hong-xin1， CUI Hai-lan2

1.Institute of Plant Protection，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Gongzhuling 136100，China；2.Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China)

This paper summarizes the development，history，current situation，and mechanisms of resistance to acetolactate synthase(ALS) inhibiting herbicides as well as the use of resistance genes. Problems associated with the use of this herbicides in China and further developments are also discussed.

weeds；acetolactate synthase(ALS)；herbicide-resistance mechanism

S451.2

A

1003-935X(2013)02-0001-05

張云月，盧宗志，李洪鑫，等. 雜草對乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑抗藥性的研究進展[J]. 雜草科學，2013，31(2)：1-5.

2013-04-27

國家“十二五”科技支撐計劃重大項目(編號：2012BAD19B02)。

張云月(1985—)，女，碩士，主要從事農田雜草抗藥性機理研究。E-mail：hettyzyy@163.com。

盧宗志，男，博士，副研究員，主要從事農田雜草研究。Tel：(0434)6283179；E-mail：luzongzhi1969@163.com。