隱球菌性腦膜炎患者真菌培養結果分析及潛在意義

成鋼衛 羅麗敏 李水彬

隱球菌性腦膜炎患者真菌培養結果分析及潛在意義

成鋼衛 羅麗敏 李水彬

目的 探討真菌培養結果對隱球菌性腦膜炎診療的意義。方法 回顧性分析了隱球菌患者的腦脊液培養結果及印度墨汁染色結果, 將兩者對照研究。結果 45例隱球菌性腦膜炎患者首次腦脊液培養結果43例陽性, 雖然高于印度墨汁染色38例陽性的結果, 但差異無統計學意義 (χ2=1.975,P= 0.157)；治療中期腦脊液培養結果30例為陽性, 和印度墨汁染色的結果比較未見差異(χ2=1.661, P=0.195)；首次腦脊液培養結果顯示26例患者對氟康唑耐藥而未見對兩性霉素B耐藥者(χ2=33.804, P=0.000);治療末期腦脊液培養的結果先于印度墨汁染色轉陰, 10例印度墨汁染色持續陽性患者, 腦脊液培養轉陰患者停藥后未見復發[P(1≤X)=0.002] 。結論 腦脊液培養對指導隱球菌腦膜炎患者抗真菌藥物的使用有重要的價值, 需高度重視;培養結果可能更適合作為停藥的指標之一。

隱球菌性腦膜炎；腦脊液；培養

隱球菌性腦膜炎診斷治療中仍存在較多的問題：有些患者需反復行腦脊液印度墨汁染色檢查才能確診；有些患者在應用氟康唑的過程中病情出現反復, 甚至出現顱內肉芽腫樣病變；有些患者在治療后期腦脊液印度墨汁染色長期陽性停藥困難；諸多問題給新型隱球菌性腦膜炎的治療帶來了更多的困惑。本研究通過對近年來隱球菌性腦膜炎患者腦脊液培養及藥敏結果的分析力圖找到上述問題的解決辦法。

1 資料與方法

1.1 入選標準 2007～2013年入住本院的患者, 患者腦脊液印度墨汁染色或培養結果發現隱球菌。

1.2 一般資料 納入試驗患者45, 其中男性29例, 女性16例；年齡14～63歲, 病程14～60d, 患者表現為不同程度的頭痛及或發熱, 極個別患者無頭痛表現為頭暈、共濟失調, 體溫36.3～39.1℃, 20例存在意識障礙, 死亡27例, 絕大多數患者腦脊液澄清, 腦脊液壓力>300 mmH2O,腦脊液蛋白含量及腦脊液白細胞絕大多數輕中度升高,并發疾病有獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS 3例), 2型糖尿病(5例), 系統性紅斑狼瘡(6例), 皮膚天皰瘡(1例), 肝硬化(2例), 惡性腫瘤(3例),腎功能衰竭, 可能病因：長期口服抗生素尤其是某些慢性鼻炎或咽喉炎患者長期局部應用抗生素(8例)；免疫功能缺陷,包括AIDS、惡性腫瘤、風濕免疫類疾病長期應用激素尤其是免疫抑制劑者(15例)；可能密切接觸真菌的患者, 例如翻新舊沙發, 居住環境過于陰暗潮濕等(9例)；長期熬夜也可能與發病有關, 原因不明者(13例)。

1.3 研究及分組方法 采用回顧性分析、自身配對分組辦法,全部患者均同時行腦脊液的印度墨汁染色及培養, 將全部患者首次的腦脊液印度墨汁染色及培養結果加以比較。將能夠堅持抗真菌治療兩周后患者的腦脊液印度墨汁染色及培養結果(31例)加以比較。將治療末期(兩性霉素B脂質體的總用量達到3.0, )18例患者的腦脊液結果加以比較。其中10例患者在導致免疫力減低的因素可控的條件下(如停用抗生素, 避免密切接觸真菌及可停用免疫抑制劑者), 在頭痛及發熱消失、腦脊液壓力小于180 mmH2O、腦脊液內白細胞數小于5×106/L 后,在印度墨汁染色仍陽性而培養結果陰性的情況下給與停藥。

1.4 治療方法 首先向患者及家屬說明病情及高昂的治療費用, 如果患者能夠承受治療風險及費用, 立即開始應用國產兩性霉素B脂質體, 藥物嚴格按照說明配置, 首次兩性霉素B脂質體10 mg+5%葡萄糖注射液500 ml 以50 ml/小時避光持續泵入, 如患者無明顯的不適, 此后兩性霉素B脂質體50 mg+5%葡萄糖注射液500 ml以 50 ml/h避光持續泵入, 每日液體入量3000 ml以上, 每日補鉀10.0 g以上, 每星期復查一次肝腎功能及電解質, 每3天行一次腰椎穿刺術, 根據病情鞘內注射兩性霉素B脂質體0.1 mg～0.5 mg, 同時通過緩慢釋放腦脊液將患者腦脊液終末壓控制在100 mmH2O, 大部分患者合用氟胞嘧啶。

1.5 統計學方法 將每個患者的腦脊液培養、藥敏結果、印度墨汁染色結果作為一個統計數據。兩組的可比性行配對χ2確切概率法計算；對于10例墨汁染色持續陽性患者停藥后的情況使用SPSS 19.0統計軟件，行Poisson檢驗, 假設檢驗采用雙側檢驗, 取α=0.05，為檢驗水準，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

全部新型隱球菌性腦膜炎患者首次腦脊液培養結果43例陽性, 印度墨汁染色陽性者38例, 兩者異無統計學意義(見表1)；治療中期腦脊液培養結果30例為陽性, 和印度墨汁染色的結果比較未見差異(見表2)；首次腦脊液培養結果顯示26例患者對氟康唑耐藥而未見對兩性霉素B耐藥者(見表3)；治療末期腦脊液培養的結果先于印度墨汁染色轉陰,10例印度墨汁染色持續陽性患者, 腦脊液培養轉陰患者停藥后未見復發[P(1≤X)=0.002], 按照文獻發病后3個月內60%的死亡率, 10例患者出現一例存活的概率計算。

表2 抗真菌治療2周后腦脊液墨汁染色和培養結果陽性率的對比(n)

表3 腦脊液培養藥敏結果對照(n)

3 討論

隱球菌腦膜炎是由隱球菌感染引起機會感染性疾病。新生隱球菌有3個變種, 即新生變種(var neoformans)、格特變種(var gattii)和上海變種(shanghaiensis)。隱球菌廣泛存在于自然環境中：如鴿糞等鳥類糞便, 腐爛的水果, 植物表面等［1］, 隱球菌性腦膜炎患者通常通過吸入隱球菌的孢子或干燥的真菌細胞進入肺部后繼發腦部病變［2］, 個別患者可通過皮膚或消化道感染［1］, 患者多為免疫功能減退患者, 也可發生于健康人［3］。在本研究中8例患者因慢性咽喉炎長期口服并局部噴涂抗生素造成口咽部菌群失調, 上呼吸道的免疫屏障破壞, 給隱球菌進入人體創造了良好的條件, 而且在病因中占很大比例, 值得引起重視［4］。風濕免疫性疾病, 比如系統性紅斑狼瘡［5］,天皰瘡等, 較易并發新型隱球菌性腦膜炎, 機理可能與疾病相關的免疫異常有關, 但和長期應用激素尤其是免疫抑制劑的關系密切。而且本研究中所有患者并無明顯的鴿子或禽類接觸史, 而有些患者的病因似乎和過于陰濕的居住環境有關。

本研究結果顯示初次腦脊液培養結果陽性例數雖然高于印度墨汁染色結果, 但兩者差異并無統計學意義, 說明在診斷方面, 腦脊液培養的結果并不明顯的優于印度墨汁染色, 這可能也是腦脊液培養在隱球菌腦膜炎的診療中不受重視的原因。在治療兩周后30例患者的腦脊液培養結果仍提示陽性, 沒有出現細菌學腦膜炎患者在應用抗生素治療后, 腦脊液培養結果難以培養出細菌的結局。雖然統計學上未顯示出與印度墨汁染色結果的差異, 但至少可以說明腦脊液培養結果與印度墨汁染色結果相匹配, 因此推測腦脊液培養結果能夠體現體內隱球菌的活力, 可以嘗試作為停藥的標準。堅持到治療末期的只有18例患者(大多數患者選擇放棄治療, 除和昂貴的治療費用關外, 治療經驗和規范的欠缺, 醫療環境的惡化也有重要關系),其中10例患者的腦脊液印度墨汁染色結果長期不轉陰, 這10例患者(患者無明顯的免疫功能減退或導致免疫功能減退的原因可控)在培養結果轉陰, 腦脊液壓力及白細胞數正常后給予停藥, 患者在隨訪0.5～6年后未再出現頭痛、發熱癥狀, 可以認為是治愈。由于治療末期病例數太少, 所以使用了泊松分布計算了死亡概率, 計算結果顯示這種結果有統計學意義。故對免疫功能正常的患者, 腦脊液培養的結果陰性后, 在患者臨床癥狀消失, 腦脊液壓力及白細胞正常后可以停藥觀察。

本研究培養結果顯示26例對氟康唑耐藥［6］, 顯示出本研究中隱球菌對氟康唑的耐藥率明顯高于對兩性霉素B的耐藥率, 目前關于隱球菌耐藥問題的研究有很大的差異, 有些研究表明隱球菌對氟康唑的敏感性非常高95.2%［7］, 有些研究顯示隱球菌對氟康唑發生耐藥的可能性非常大51.6%［8］。所以結合本研究的具體情況, 按照有關文獻隱球菌對氟康唑51.6%的耐藥率計算, 兩性霉素B出現1例耐藥的幾率也小, 只有假設隱球菌對氟康唑的耐藥率10%時, 這種情況才有可能發生, 但在假設10%的氟康唑耐藥率的情形下, 本研究中最多出現8例耐藥患者, 遠高于本研究中26例耐藥患者的出現率。而且在臨床工作中, 有些患者在應用氟康唑3-7天后頭痛有緩解, 但通常兩周后又出現難以緩解的頭痛, 提示異質性耐藥［9］, 即在體外的常規藥敏試驗中 ,菌株表現為敏感 ;若改用特殊的方法檢測 ,則發現細胞的大部分亞群屬于敏感 ,但有一小部分亞群屬于耐藥菌。相關的動物試驗也證明：在使用氟康唑14天時, 顱內的真菌含量又復增加, MIC(minimal inhibitory concentrations) 水平明顯地升高［10］。另外有些患者應用氟康唑(2～3月)后病情仍難以治愈, 顱內出現肉芽腫樣病變[11～12]。所有這些都證明了氟康唑耐藥亞群是廣泛存在的, 并不像估計的那么樂觀。體外培養耐藥或存在異質性耐藥可能是氟康唑治療失敗的原因, 雖然本研究對隱球菌耐藥的機制尚難解釋。

鑒于本研究藥敏結果, 所以在制定治療方案時腦脊液培養尤為重要, 根據藥敏結果應用抗真菌藥物應該成為臨床的標準措施;同時對臨床癥狀消失的患者,在印度墨汁染色持續陽性的情況下,腦脊液培養結果陰性患者可以停藥觀察,因為大部分患者在應用兩性霉素B脂質體治療末期,都會出現不同程度的肝腎損害,繼續盲目用藥可能造成永久的不可逆轉的肝腎損害。

［1］ Negroni R.Cryptococcosis. Clin Dermatol.2012,30(6):599-609.

［2］ Sabiiti W, May RC.Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.Future Microbiol,2012,7(11):1297-313.

［3］ Rocha KC, Pinhal C, Cavalcanti S,et al.Lymphocyte transformation assay for C neoformans antigen is not reliable for detecting cellular impairment in patients with Neurocryptococcosis.BMC Infect Dis,2012 ,30;12(1):278.

［4］ Hosseinnezhad A, Rapose A.Cryptococccal meningoencephalitis after H1N1 influenza.BMJ Case Rep,2012 ,2012.

［5］ Subils GC, Maldonado FS.Cryptococcal meningitis as initial presentation of systemic lupus erythematosus.Rev Fac Cien Med Univ Nac Cordoba,2012 ,69(1):47-50.

［6］ Flores VG, Tovar RM, Zaldivar PG, et al.Meningitis due to Cryptococcus neoformans: treatment with posaconazole.Curr HIV Res,2012 ,10(7):620-3.

［7］ Matos CS, de Souza Andrade A, Oliveira NS,et al.Microbiological characteristics of clinical isolates of Cryptococcus spp.in Bahia,Brazil: molecular types and antifungal susceptibilities.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012,31(7):1647-52.

［8］ Trpkovi A, Pekmezovi M, Bara A,et al.In vitro antifungal activities of amphotericin B, 5-fluorocytosine, fluconazole and itraconazole against Cryptococcus neoformans isolated from cerebrospinal fluid and blood from patients in Serbia.J Mycol Med, 2012, 22(3):243-8.

［9］ Varma A, Kwon-Chung KJ.Heteroresistance of Cryptococcus gattii to fluconazole.Antimicrob Agents Chemother,2010,54(6):2303-11.

［10］ Mendes FE, Oliveira LV, Faria ES,et al.Correlation of the in vitro antifungal drug susceptibility with the in vivo activity of fluconazole in a murine model of cerebral infection caused by Cryptococcus gattii.Eur J Clin Microbiol Infect Dis.2010 ,29(12):1525-32.

［11］ Musubire AK, Meya BD, Mayanja-Kizza H, et al.Challenges in diagnosis and management of Cryptococcal immune reconstitution inflammatory syndrome (IRIS) in resource limited settings.Afr Health Sci,2012,12(2):226-30.

［12］ Inoue A, Harada H, Iwata S, et al. Intraventricular cryptococcoma successfully treated with liposomal amphotericin B and voriconazole: a case report .Curr HIV Res,2012,10(7):620-3.

The Analysis and potentialsignificance of cerebrospinal fluid Culture in patients with cryptococcal meningitis

CHENG Gang-wei , LUO Li-min , LI Shui-bin.
Department of Neurology, People's Hospital of Meizhou City, Meizhou 514031,China

Objective To explore the significance of CSF (cerebralspinal fluid )culture in patients with cryptococcal meningitis.Methods Analysed the cerebrospinal fluid culture results amd India ink stain results of paitients with cryptococal meningitis.Results CSF culture was positive in 43 cases among 45 patients with cryptococcal meningitis in the first time test, higher than that(38) in the India ink stain ,but no statistical difference(χ2=1.975, P= 0.157); CSF culture Results of 30 cases were positive after two weeks treatment, compared with the India ink staining Results showed no difference (χ2=1.661 2, P= 0.195) ; CSF culture showed 26 patients resistant to fluconazole and none resistant to amphotericin B (χ2=33.804 2, P= 0.000); At the end of period of treatment, CSF culture Results turned to negative earlier than that in the India ink staining .10 cases of India ink stain positive patients had no recurrence ,when withdraw antifungal drugs after CSF culture turned to negative [P(1≤X)=0.002].Condlusion We highlight the importance of CSF cultures in guiding treatment decisions in the patients with cryptococcal meningitis.CSF culture may be more reliable as the criterion for stopping treatment .

CSF; Cryptococcal meningitis culture

514031 梅州市人民醫院神經內二科

成鋼衛 E-mail：chenggangweinan@yahoo.com.cn