正交設(shè)計(jì)和動(dòng)態(tài)過程優(yōu)化兩面針超聲提取工藝

陸世惠，鄧鳳云，盧紅梅

1右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;2廣西百色市中醫(yī)醫(yī)院，百色 533000

兩面針，Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.，又名釘板刺、入山虎、入地金牛等，系蕓香科花椒屬植物，主要分布于廣西、廣東、云南、貴州等地，主治風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、胃痛、牙痛、毒蛇咬傷等癥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明其有抗癌作用，其主要含生物堿，且主要為苯并菲啶類生物堿［1］。因此，提取兩面針總生物堿具有重要意義。作者［2］證實(shí)用纖維素酶、果膠酶預(yù)處理兩面針后再提取，可促進(jìn)總生物堿提取率的提高。莫肖云等［3］初步探索了超聲法提取兩面針總生物堿，不過提取率較低，需要進(jìn)行工藝優(yōu)選。目前正交設(shè)計(jì)優(yōu)選工藝的提取時(shí)間多是間隔一定時(shí)間進(jìn)行考察，各次提取都用相同時(shí)間。而實(shí)際上提取過程是動(dòng)態(tài)變化的，且各次提取達(dá)到穩(wěn)態(tài)期的時(shí)間并不相同，動(dòng)態(tài)過程優(yōu)化工藝能減少提取時(shí)間，降低生產(chǎn)成本［4］。為此，本實(shí)驗(yàn)研究酶解預(yù)處理后超聲提取兩面針總生物堿的工藝，先用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化，再動(dòng)態(tài)過程進(jìn)一步優(yōu)化提取時(shí)間。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TU1800紫外可見光分光光度計(jì)(北京普析通用公司);FA2004N型電子分析天平(上海民析精密科學(xué)儀器公司);KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司);CU-600型電熱恒溫水槽(上海齊欣科學(xué)儀器公司)。

1.2 試藥

氯化兩面針堿對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):848-9901);纖維素酶(10000 U/g，南寧東恒華道生物制品公司);果膠酶(10000 U/g，南寧東恒華道生物制品公司);其他試劑均為分析純。兩面針?biāo)幉馁徸詮V西南寧市藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為兩面針Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.的根和莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿的測(cè)定方法［5］

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取氯化兩面針堿對(duì)照品10.4 mg，甲醇溶解定容至50 mL得儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液50、100、200、300、400 和 500 μL，以體積分?jǐn)?shù) 60% 乙醇-pH5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液定容至10 mL，以溶劑為參比(蒸餾水吸光度為0，可代替溶劑)，于328 nm處測(cè)定吸光度(A)，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程 A=0.09568X-0.0083(r=0.9995)，線性范圍1.04～10.40 mg/L。

2.1.2 樣品測(cè)定方法

將溶液樣品乙醇體積分?jǐn)?shù)調(diào)節(jié)至60%，1000 rpm離心5 min，傾出上清液作為供試液，精密取供試液適量，以標(biāo)準(zhǔn)曲線制備法測(cè)定總生物堿含量，計(jì)算總生物堿提取率(總生物堿提取率=提取得的總生物堿質(zhì)量/藥材中總生物堿的質(zhì)量×100%)。

2.1.3 精密度試驗(yàn)

取5.20 μg/L的對(duì)照品溶液反復(fù)測(cè)定吸光度6次，以吸光度計(jì)算，RSD為0.12%。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品溶液適量，依法分別于 0、4、8、16、24、48 h測(cè)定吸光度，RSD為0.35%。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品溶液適量，平行5份，依法測(cè)定吸光度，RSD為0.23%。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知濃度的樣品溶液適量，平行5份，加入對(duì)照品適量，依法測(cè)定吸光度，結(jié)果平均加樣回收率為99.6%，RSD為0.93%。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選超聲條件

將兩面針?biāo)幉姆鬯?粒徑≤0.5 mm)，準(zhǔn)確稱取藥粉100 g，加入4倍量 pH 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，用纖維素酶和果膠酶(酶底物質(zhì)量比均為1∶250)于室溫(30℃)下預(yù)處理30 min，然后用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇(含鹽酸5 g/L)［2］進(jìn)行超聲提取。經(jīng)單因素預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲功率越大提取率越高，提取次數(shù)影響較大，超聲時(shí)間超過15 min提取率增加不明顯，而溶劑量影響較小。因此，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，考察超聲功率(A)、提取次數(shù)(B)及超聲時(shí)間(C)對(duì)總生物堿提取率的影響，因素水平見表1(若酶解后濾過，棄去濾液將造成損失。為簡化工藝流程，酶解后不經(jīng)濾過直接加乙醇、鹽酸到原緩沖液中配成第1次提取溶劑，至少配成10倍量才能達(dá)到乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。后續(xù)提取的溶劑量一般少于第1次，且不少于3倍量。故第1、2、3次提取分別用10、4、3倍量溶劑)。為提高統(tǒng)計(jì)分析的可靠性，重復(fù)試驗(yàn)1次，測(cè)定結(jié)果取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

從直觀分析可見，因素影響大小為B＞A＞C，提取次數(shù)影響最大，超聲功率次之，超聲時(shí)間影響最小;從方差分析可見，提取次數(shù)的影響具有顯著性。因此，最佳組合為A3B3C2，即9號(hào)試驗(yàn):用250 W超聲功率提取3次，每次15 min。

表1 超聲提取因素水平表Table 1 Factors and levels of ultrasonic extraction

表2 超聲提取L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(34)orthogonal test of ultrasonic extraction

表3 超聲提取方差分析Table 3 Analysis of variance of ultrasonic extraction

2.3 動(dòng)態(tài)過程優(yōu)化超聲提取時(shí)間

按正交試驗(yàn)優(yōu)選出的工藝進(jìn)行超聲提取，提取時(shí)間延長至24 min，在提取過程中每隔3 min抽取提取液5 mL，每次補(bǔ)足相同體積的60%乙醇(含鹽酸5 g/L)。依法測(cè)定各樣品液中的總生物堿濃度，結(jié)果見表4。

表4 超聲提取各時(shí)間點(diǎn)提取液中的總生物堿濃度(g/L)Table 4 Content of total alkaloids in extract at different time of ultrasonic extraction(g/L)

通過表4可見，第1次提取15 min后，總生物堿濃度變化不超過1%;第2次提取12 min后，總生物堿濃度變化不超過2%;第3次提取9 min后，總生物堿濃度變化不超過3%。因此確定第1次超聲提取穩(wěn)態(tài)期為15 min，第2次超聲提取穩(wěn)態(tài)期為12 min，第3次超聲提取穩(wěn)態(tài)期為9 min，這就是各次超聲提取的最佳時(shí)間。

2.4 最佳工藝驗(yàn)證及提取方法對(duì)比

按動(dòng)態(tài)過程優(yōu)化的超聲提取工藝平行進(jìn)行3份實(shí)驗(yàn)，總生物堿平均提取率為87.80%，RSD為0.98%。另按正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出的超聲提取工藝平行進(jìn)行3份實(shí)驗(yàn)，總生物堿平均提取率為87.93%，RSD為0.84%。可見，經(jīng)動(dòng)態(tài)過程優(yōu)化提取時(shí)間，在保持總生物堿提取率的條件下，能進(jìn)一步節(jié)能省時(shí)20%。

3 結(jié)論與討論

本研究綜合運(yùn)用正交設(shè)計(jì)和動(dòng)態(tài)過程優(yōu)選兩面針超聲提取工藝，這兩種方法具有互補(bǔ)作用。正交設(shè)計(jì)是常規(guī)的工藝優(yōu)選方法，能夠用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)優(yōu)選出比較科學(xué)合理的工藝，但是該法有二個(gè)不足，第一是當(dāng)設(shè)計(jì)時(shí)間間隔較寬時(shí)難以選出最佳時(shí)間點(diǎn)，第二是多次提取都用相同的時(shí)間，而實(shí)際上后續(xù)提取往往較快達(dá)到穩(wěn)態(tài)期，以相同時(shí)間提取就浪費(fèi)能源和時(shí)間，隨意縮短提取時(shí)間又缺乏依據(jù)，這也是該法最大的缺陷。動(dòng)態(tài)過程優(yōu)化法在一次實(shí)驗(yàn)中連續(xù)多次取樣檢測(cè)，可以準(zhǔn)確把握每次提取達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間，彌補(bǔ)正交設(shè)計(jì)的不足。從提取物濃度變化的動(dòng)態(tài)過程中可以看到，隨著提取次數(shù)的增加，提取到達(dá)穩(wěn)態(tài)的時(shí)間越來越短，用動(dòng)態(tài)過程優(yōu)化工藝能夠進(jìn)一步節(jié)約能源，提高工作效率。此外，本工藝先以復(fù)合酶預(yù)處理藥材，減小了有效成分溶出的傳質(zhì)阻力，再以超聲波的空化作用和機(jī)械振動(dòng)促進(jìn)提取的進(jìn)行，共同提高了總生物堿提取率和工作效率。因此，本工藝具有高效、節(jié)能、省時(shí)的特點(diǎn)。

1 Liu YC(劉延成)，Cheng FJ(成風(fēng)杰)，Meng YQ(蒙衍強(qiáng))，et al.Research progresses on the chemical components，pharmacological activity，and antitumoral mechanism of Zanthoxylum nitidum.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:550-555.

2 Lu SH(陸世惠)，Deng FY(鄧鳳云)，Lu HM(盧紅梅)，et al.Optimization of extraction technology for total alkaloids from Zanthoxylum nitidum by enzymatic hydrolysis assisted immersion method.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2012，18(23):43-45.

3 Mo XY(莫肖云)，Huang LX(黃麗秀)，Tian FN(田芳年)，et al.Ultrasound extraction the tota1 alkaloids from the Zanthoxylum nitidum.Chin Wild Plant Res(中國野生植物資源)，2009，28(5):58-62.

4 Wang DZ(王東喆)，Zhang J(章軍)，Zhang LY(張麗艷)，et al.Research on the dynamic process optimization method of extraction technology.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2012，37:1388-1391.

5 Lu SH(陸世惠)，Long SJ(龍盛京).Determination of total alkaloids from Zanthoxylum nitidum in extraction solution by UV.Northwest Pharm J(西北藥學(xué)雜志)，2008，23:350-352.