新疆不同地區產蜂膠抗氧化活性研究

尼砸木·艾海提，買熱艷木·艾爾肯，祖麗比亞·司馬義，依米提·熱合曼

新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046

蜂膠具有抗氧化、抗菌、等多種藥理活性，在民間醫療中具有悠久的歷史。蜂膠基本成分是樹脂(類黃酮和相關的酚酸)、蠟、揮發油、花粉［1］，目前蜂膠中鑒定出的化合物中黃酮類化合物71種，芳香酸及其酯59種，咖啡酸酯類化合物近10種［2］。日本研究者Yoshimi Nakajima對巴西蜂膠水提物，醇提物及花粉的抗氧化活性進行比較研究中發現巴西蜂膠醇提物表現較強羥基和超氧陰離子自由基清除化活性［3］。

新疆具有豐富的蜂膠資源，蜂膠的生物學活性受生態系統和氣候條件的影響，由于新疆區內各地生態環境差異較大，在新疆不同區域產蜂膠成分也必然存在一定的差異同時具有相似的一些生物學活性，在這科研領域內有關基于新疆產蜂膠進行研究的報道很少，因此我們使用新疆伊犁那拉提，尼勒克縣產蜂膠抗氧化活性進行研究為蜂膠研究開發提供一些實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蜂膠取自新疆伊犁那拉提、尼勒克縣蜂場(采集時間為2011年秋季)。槲皮素、蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號080-9705);二苯代苦味酰自由基(DPPH，Sigma產品);無水乙醇、5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、5%氫氧化鈉、焦性沒食子酸(鄰苯三酚)、Tris-鹽酸、鹽酸等試劑均為市售國產分析純;水為純化水。離心機(上海安亭醫用儀器廠);UV-3600型紫外線分光光度計(UV-2100型，上海分析儀器廠);電子天平(JA1203型，上海天平儀器廠);GKC型水浴鍋;RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量的測定

1.2.1.1 蜂膠醇提物的制備

將原料蜂膠加入冰箱冷凍5 h(蜂膠在15℃以下變硬變脆，在此溫度以上具有粘性，不便粉碎)，粉碎取2 g粉碎的蜂膠，按料液比10∶1用濃度為95%的乙醇，浸提34 h，提取溫度34℃，離心分離取上清液旋轉蒸發濃縮得浸膏，在烘箱中烘至恒重。

1.2.1.2 標準曲線制作

稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁標準品20.00 mg，置100 mL容量瓶中加入乙醇溶液定容，即得0.2 mg/mL蘆丁標準液。取蘆丁標準液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 分別置于 25 mL 容量瓶中，各加乙醇6 mL，5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖均，放置10 min;加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖均，放置10 min;加5%氫氧化鈉溶液10 mL，搖均，加乙醇定容，放置15 min;以鋪料溶液作為空白，同蘆丁標準曲線一樣配置樣品溶液，取1 mL置于25 mL容量瓶中加乙醇6 mL，空白對照直接加乙醇至25 mL容量瓶中，其余操作同蘆丁標準曲線的繪制方法。蘆丁對照品乙醇溶液及蜂膠提取液用NaNO2、A1(NO)3、NaOH顯色后，于200～700 nm間掃描，在500 nm處有均最大吸收，因此選擇500 nm為測定波長［4，6］。

總黃酮含量計算公式:

式中:S:總黃酮含量%;C:通過標準曲線差的總黃酮質量濃度(mg/mL);M:蜂膠用量(g)。

1.2.2 抗氧化活性測定

1.2.2.1 蜂膠醇提物超氧陰離子自由基清除率測定

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)1.4 mL，置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入試樣1 mL和2 mmol/L聯苯三酚溶液0.1 mL，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入8 mol/L HCl 0.5mL終止反應，325 nm處測定光密度D(λ)i對照組以相同體積的蒸餾水代替樣品。每個試樣作5次平行實驗，取其平均值。清除率計算公式為［7］

式中:D(λ)o為空白對照的光密度;D(λ)i為試樣的光密度。

1.2.2.2 蜂膠醇提物DPPH清除率測定

取2 mL不同濃度的蜂膠醇提物液液于試管中，加入2 mL DPPH溶液(無水醇配制)，混合均勻，反應30 min后在518 nm測定其吸光度Ai，以2 mL水代替樣品Ac，以2 mL樣品與2 mL無水乙醇混合液為Aj，以消除樣品本身的影響，以2 mL水與2 mL無水乙醇的混合液調零點［8］。

式中:Ai=2 mL DPPH溶液+2 mL待測溶液吸光度值;Aj=2 mL待測溶液+2 mL溶劑的吸光度值;Ac=2 mL DPPH溶液+2 mL溶劑的吸光度值。

1.2.2.3 蜂膠醇提物羥基自由基清除率

取0.2 mL的FeSO4-EDTA(10 mmol/L)混合液于具塞試管中，加入0.2 mL的2-脫氧-D-核糖溶液(10 mmol/L)，然后再加入一定量的樣品溶液，并用磷酸緩沖液(pH 7.4)定容到1.8 mL，最后加入0.2 mL的H2O2(10 mmol/L)，混勻后于37℃保溫1 h，再加入2.8%三氯乙酸1.00 mL，1.0%硫代巴比妥酸溶液1 mL，混勻后，沸水浴煮沸10 min，冷水冷卻。不加DR的反應混合液不發生反應，作為比色時的空白液，測 A532，計算清除率 P［9］。

式中:As:加樣品液并在37℃水浴中反應的吸光值;Ac:不加樣品液，同上操作的吸光值;Ao:不加樣品液并且不在37℃水浴中反應的吸光值。

1.3 數據統計

為了檢驗不同濃度梯度樣品抗氧化活性與陽性對照間有無顯著差異，使用SPSS 13.0軟件進行數據處理，用單因素方差分析的方法，檢驗水準:α =0.05;測定樣品的半清除率使用單因素線性回歸分析。

2 實驗結果

2.1 蜂膠黃酮含量

伊犁那拉提縣和尼勒克縣蜂膠經過95%乙醇提取后提取率分別為40%、34%。以質量濃度對吸光度作圖，線性回歸得蘆丁質量濃度(x)和吸光度(y)的回歸方程為 y=9．8223x-0．003(R2=0.9998)。伊犁那拉提縣和尼勒克縣蜂膠總黃酮含量分別為9.015±0.203%、7.710±0.259%，總黃酮含量無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 蜂膠醇提物超氧自由基清除作用

槲皮素作為陽性對照，使用濃度為100、80、40、20、10 μg/mL的蜂膠醇提物測定對超氧陰離子自由基的清除能力，結果表1顯示，隨著那拉提、尼勒克蜂膠醇提物濃度升高對超氧陰離子自由基清除活性也增加，當濃度為100 μg/mL時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對超氧陰離子自由基清除活性與槲皮素進行比較，沒有顯著差異(P ＞0.05)，濃度為80、40、20、10 μg/mL時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對超氧陰離子自由基的清除能力顯著低于槲皮(P ＜0.01)。那拉提蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=1.355X-21．27，R2=0.9584，IC50=46.48 μg/mL;尼勒克蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=1．3152X-18．568，R2=0.9477，IC50=47.19 μg/mL;槲皮素回歸曲線方程:Y=1．7769X-67．585，R2=0.9591，IC50=21.26 μg/mL(X:清除率;Y:樣品濃度)。

表1 那拉提、尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性(n=5，±s)Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

表1 那拉提、尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性(n=5，±s)Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

注:與槲皮素比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with quercetin，*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01.

樣品濃度Sample concentration(μg/mL)那拉提蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati(%)尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nileke(%)槲皮素超氧陰離子清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of quercetin(%)100 87.66±3.50 89.33±2.41 92.36±1.46 80 70.50±1.96＊＊ 68.73±2.31＊＊ 81.80±1.28 40 53.10±1.55＊＊ 51.16±1.47＊＊ 62.63±1.20 20 34.6±1.08＊＊ 36.53±1.90＊＊ 55.66±1.45 10 17.13±1.29＊＊ 14.93±2.23＊＊38.43±0.97

2.3 蜂膠醇提物DPPH清除作用

表2顯示隨著那拉提、尼勒克蜂膠醇提物濃度升高對DPPH自由基清除作用也呈顯增加趨勢，當濃度為40 μg/mL時那拉提蜂膠醇提物對DPPH自由基清除作用與槲皮素進行比較，沒有顯著差異(P＞ 0.05);濃度為 20、10、8、5 μg/mL 時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對DPPH自由基清除作用清除能力顯著低于槲皮素(P＜0.01)。那拉提蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=0．7422X-17．724，R2=0.8951，IC50=18.37 μg/mL;尼勒克蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=0．8323X-21．494，R2=0.9054，IC50=20.12 μg/mL;槲皮素回歸曲線方程:Y=1．0274X-41．41，R2=0.9141，IC50=9.95 μg/mL(X:清除率;Y:樣品濃度)。

表2 那拉提和尼勒克蜂膠醇提物DPPH自由基的清除活性(n=5，±s)Table 2 DPPH radical-scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

表2 那拉提和尼勒克蜂膠醇提物DPPH自由基的清除活性(n=5，±s)Table 2 DPPH radical-scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

樣品濃度Sample concentration(μg/mL)那拉提蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati(%)尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nileke(%)槲皮素超氧陰離子清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of quercetin(%)74.67±1.10 40 71.67±1.15 68.9±1.85*

注:與槲皮素比較，P ＜0.05，P ＜0.01。Note:Compared with quercetin，*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01.

2.4 蜂膠醇提物羥基自由基清除作用

表3顯示，槲皮素作為陽性對照使用濃度為100、80、40、20、10 μg/mL 的蜂膠醇提物測定其對羥基自由基的清除能力。隨著那拉提、尼勒克蜂膠醇提物濃度升高對羥基自由基清除活性也呈顯增加趨勢。當濃度為100、80 μg/mL時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對羥基自由基清除作用與槲皮素進行比較，沒有顯著差異(P ＞ 0.05);濃度為40、20、10 μg/mL時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對羥基自由基的清除能力顯著低于槲皮素(P＜0.01)。那拉提蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=1.0819X-16.55，R2=0.8912，IC50=37.54 μg/mL;尼勒克蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=1.1327X-20.746，R2=0.9163，IC50=36.24 μg/mL;槲皮素回歸曲線方程:Y=1.2817X-36.167，R2=0.9221，IC50=28.18 μg/mL(X:清除率;Y:樣品濃度)。

表3 那拉提和尼勒克蜂膠醇提物羥基自由基的清除活性(n=5，±s)Table 3 Hydroxyl radicals-scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

表3 那拉提和尼勒克蜂膠醇提物羥基自由基的清除活性(n=5，±s)Table 3 Hydroxyl radicals-scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

注:與槲皮素比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with quercetin，*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01.

樣品濃度Sample concentration(μg/mL)那拉提蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati(%)尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nileke(%)槲皮素超氧陰離子清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of quercetin(%)100 93.53±2.67 94.3±1.60 96.17±1.21 80 91.16±1.70 90.46±1.52 93.03±0.90 40 69.67±1.60＊＊ 68.50±1.15＊＊ 71.10±1.17 20 35.50±1.21＊＊ 37.20±1.05＊＊ 44.03±0.58 10 17.69±1.13＊＊ 20.73±0.78＊＊31.10±0.70

3 討論

蜂膠的化學成分復雜，其中主要的功效成分為黃酮類化合物。新疆那拉提、尼勒克縣產蜂膠總黃酮含量分別為9.015±0.203%、7.710±0.259%，總黃酮含量無顯著差異(P ＞0.05)，其醇提物對DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除作用。本實驗槲皮素作為陽性對照評價那拉提、尼勒克縣產蜂膠醇提物的抗氧化活性;那拉提、尼勒克縣產蜂膠醇提物濃度100 μg/mL時對超氧陰離子自由基清除活性與槲皮素比較沒有顯著差異(P＞0.05);那拉提、尼勒克縣產蜂膠醇提物IC50為46.48 μg/mL、47.19 μg/mL，槲皮素 IC50為 21.26 μg/mL;當那拉提、尼勒克縣產蜂膠醇提物濃度為100、80 μg/mL羥基自由基的清除活性與槲皮素比較，沒有顯著差異(P ＞0.05);那拉提、尼勒克縣產蜂膠醇提物 IC50為37.54、36.24 μg/mL，槲皮素 IC50為28.18 μg/mL;濃度為40 μg/mL 時那拉提蜂膠醇提物對DPPH自由基清除活性與槲皮素進行比較，沒有顯著差異(P ＞0.05)，那拉提、尼勒克縣產蜂膠醇提物 IC50為18.37、20.12 μg/mL，槲皮素 IC50為9.95 μg/mL。蜂膠的生物學、藥理學及醫療功效主要與蜂膠中所含的黃酮成分有關。研究表明，黃酮類化合物不僅可以清除機體內外的自由基，同時對自由基和脂質過氧化引起的多種疾病有治療作用，蜂膠作為一種天然抗氧化劑和活性氧清除劑，能防止機體各種疾病的引發良好天然產物。

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