配體交換毛細管電泳法拆分色氨酸對映體

王靜萍，劉 燕，周 靜

（山西師范大學(xué) 分析測試中心，山西 臨汾 041004）

氨基酸的手性拆分在多肽、蛋白質(zhì)的研究、有機化學(xué)不對稱合成、醫(yī)藥、食品以及生命的起源、發(fā)育、病變及衰老的研究中，均具有重要意義[1]。隨著生命科學(xué)和生物工程的進展，氨基酸的手性拆分將具有越來越重要的意義。以前對氨基酸的手性拆分多采用高效液相色譜（HPLC），其分析成本高，效率低。毛細管電泳（CE）是20世紀80年代發(fā)展起來的一種高效液相分離技術(shù)。CE因其高效、快速、選擇性強等特點而成為目前最簡單高效的手性拆分方法[2]。

Davankov和Rogozhin首次提出了配體交換法（ligand-exchange，LE）.LE即手性配體與金屬離子形成絡(luò)合物并與待測對映體發(fā)生交換作用。配體交換法應(yīng)用于毛細管電泳中的第一例就是Zare工作組[3]用 L-組氨酸、天冬氨酸與銅（Ⅱ）[4]結(jié)合分離丹酰化氨基酸。Hobo等結(jié)合膠束電動毛細管色譜法（MEKC）和配位體交換法，成功地分離了既具有位置異構(gòu)又含有鏡像異構(gòu)的苯丙氨酸衍生物以及色氨酸羥基、烷基化衍生物[5]，同時發(fā)現(xiàn)兩種鏡像體的出峰順序受到表面活性劑濃度的影響，并利用這一現(xiàn)象測定了表面活性劑SDS形成膠束的臨界濃度[6]。

本實驗利用配體交換毛細管電泳法對色氨酸對映體分離進行了研究，考察了緩沖液的pH值，D-葡萄糖酸鈉及Cu（Ⅱ）的濃度對分離的影響，結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CL1020高效毛細管電泳儀（CE）兼紫外檢測器（UV），北京彩陸科學(xué)儀器有限公司；高壓直流電源（最大電壓30kV），為高效毛細管電泳儀提供高壓直流電場驅(qū)動力；毛細管，永年瑞豐色譜儀器公司；色譜工作站，上海千譜軟件公司；PHS-3C型酸度計，上海偉業(yè)儀器廠。

D-葡萄糖酸鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DL-色氨酸，北京化學(xué)試劑經(jīng)銷部；CuSO4·5H2O，分析純，新鄉(xiāng)市化學(xué)試劑廠；鹽酸，分析純，洛陽市化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉，分析純，洛陽市化學(xué)試劑廠。

1.2 溶液的配制

1）樣品溶液的配制。室溫下直接將0.05g DL-色氨酸溶于去離子水，配制成濃度為1000mg／L的DL-色氨酸溶液，進樣時稀釋到所需濃度。

2）緩沖液的配制。將D-葡萄糖酸鈉溶于去離子水，根據(jù)實驗需要，加入Cu（Ⅱ）配制成緩沖溶液，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH。

樣品溶液及緩沖液在使用前用0.45μm的濾膜過濾并超聲波脫氣處理5min，二次水用于整個實驗過程。

1.3 實驗方法

新毛細管在使用前依次用甲醇沖洗30min，0.1mol／L HCl沖洗30min，二次蒸餾水沖洗5 min，0.1mol／L的NaOH沖洗1h。采用重力進樣，進樣高度差為20cm，進樣時間15s。實驗在恒溫（25℃）及紫外吸收測量波長208nm條件下進行。毛細管電泳分離色氨酸的實驗操作參數(shù)如下：毛細管柱50cm×75μm×42cm；運行緩沖液為10 mmol／L D-葡萄糖酸鈉和5mmol／LCu（Ⅱ）溶液；分離電壓為15kV.

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖溶液pH值的影響

pH值是配體交換分離中的一個重要影響因素，pH值通過影響待測氨基酸以及手性配體的離解程度從而影響配合物的形成。

在D-葡萄糖酸鈉與Cu（Ⅱ）的濃度分別為10 mmol／L和5mmol／L條件下，改變緩沖液pH進行實驗，結(jié)果如圖1所示。當pH為4.7時，分離效果最好，所以實驗選擇在pH為4.7的條件下進行，結(jié)果見圖1。

圖1 pH對分離的影響

2.2 DL-色氨酸與Cu（Ⅱ）濃度比對分離度的影響

本實驗中的手性分離是基于待測色氨酸與D-葡萄糖酸鈉和Cu（Ⅱ）形成三元絡(luò)合物的穩(wěn)定程度來決定，因此通過優(yōu)化D-葡萄糖酸鈉與Cu（Ⅱ）的濃度比可以提高分離效率。固定Cu（Ⅱ）的濃度為5mmol／L，改變D-葡萄糖酸鈉的濃度來考察二者摩爾濃度比對分離的影響。由表1可知，濃度比為2∶1時分離效果最好。

表1 DL-色氨酸與Cu（Ⅱ）濃度比對分離度的影響

2.3 D-葡萄糖酸鈉與Cu（Ⅱ）濃度對分離度的影響

保持D-葡萄糖酸鈉與Cu（Ⅱ）濃度比為2∶1，考察選擇劑濃度對分離效果的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，D-葡萄糖酸鈉濃度為10mmol／L，Cu（Ⅱ）的濃度為5mmol／L時分離效果最佳。

表2 D-葡萄糖酸鈉與Cu（Ⅱ）濃度對分離度的影響

2.4 進樣時間的影響

進樣時間的長短決定了進樣量的大小。進樣時間太短，進樣量太小影響檢測的靈敏度；進樣時間太長，樣品峰變寬，影響分離效率和分離度。考察了進樣時間對分離度的影響，結(jié)果見表3.可看出，進樣時間為15s時，效果最好。

表3 進樣時間對分離度的影響

2.5 分離電壓的影響

提高電壓可以提高分離度，縮短分析時間。但是分離電壓過高，電泳電流顯著增加，基線波動較大，分離度和柱效反而降低。電泳電壓從10kV增加到20kV，考察了電壓對分離度的影響，見表4。綜合考慮焦耳熱和毛細管散熱等因素，選擇15kV作為分離電壓，在pH＝4.7，D-葡萄糖酸鈉與Cu（Ⅱ）濃度比＝2∶1，D-葡萄糖酸鈉濃度為10mmol／L，Cu（Ⅱ）的濃度為5mmol／L條件下考察了電泳分離情況，見圖2.可看出，色氨酸的兩個對映體達到基線分離。

表4 分離電壓對分離度的影響

圖2 優(yōu)化條件下DL-色氨酸的毛細管電泳分離譜圖

3 結(jié)論

本實驗以D-葡萄糖酸鈉和Cu（Ⅱ）的絡(luò)合物為手性選擇劑，利用配體交換毛細管電泳法對色氨酸對映體進行拆分，確定了最適宜的實驗條件為D-葡萄糖酸鈉與Cu（Ⅱ）濃度比為2∶1，D-葡萄糖酸鈉濃度為10mmol／L，Cu（Ⅱ）的濃度為5mmol／L，pH＝4.7，進樣時間為15s，分離電壓為15kV，在最適宜條件下色氨酸對映體的分離度為1.94。

[1]趙艷芳，趙亮，明永飛，等.配體交換毛細管區(qū)帶電泳拆分未衍生化氨基酸[J].分析化學(xué)，2006，34（z1）：87-90.

[2]Juvancz Z，Kendrovies R B，Ivanyi R，et al.The role of cyclodextrins in chiral capillary electrophoresis[J].Electrophoresis，2008，29（18）：1701-1712.

[3]Gassmann E，Kuo J E，Zare R N.Electrokineric separation of chiral compounds[J].Science，1985，230（7）：813-814.

[4]Gozel P，Gassmann E，Michelsen H，et al.Electrokineric resolution of amino acid enatiomers with ciooer（Ⅱ）-aspartame support electrolyte[J].Anal Chem，1987，59（13）：44-49.

[5]Chen L，Hobo T.Determination of critical micelle concentrations of anionic surfactants based on ligand exchange micellar electrokinetic chromatography[J].Chromatographia，1999，49（23）：436-443.

[6]Chen L，Lin J M，Hobo T.Determination of critical micelle concentrations of anionic curfactants based on ligand exchange micellar electrokineric chromatrgraphy[J].Anal Chim Acta，2000，403（36）：173-178.