超高效液相色譜-質譜法測定豬肉中9種β-受體激動劑殘留量

(中國熱帶農業科學院農產品加工研究所,湛江524001)

β-受體激動劑(β-agonists)，是一類人工合成的藥物，在藥學上稱為β-腎上腺素受體興奮劑[1]。主要用于防治人、獸的支氣管哮喘和支氣管痙攣等癥狀。根據苯環取代基及其結構，β-受體激動劑可分為苯胺型(克倫特羅、西馬特羅)、苯酚型(沙丁胺醇)、間苯二酚型(特布他林、萊克多巴胺、非諾特羅)[2]。研究表明，在動物飼料中添加β-受體激動劑具有營養再分配作用，可以明顯提高動物瘦肉率，因而常被非法用于動物飼養中[3]。長期食用含有β-受體激動劑殘留的食品會對人體健康產生極大的危害，甚至危害生命。目前，我國對該類藥物在動物飼養及相關產品中的使用都有嚴格的規定，并已將β-受體激動劑類列為動物源性食品中的重點監控藥物，農業部和各省市農業主管部門均有相關機構對畜禽產品中β-受體激動劑進行監測。

目前已報道的β-受體激動劑檢測方法主要有酶聯免疫法[4-6]、高效液相色譜法[7，8]、氣質聯用法[9-11]和液質聯用法[12-14]等。各個方法均有其優缺點，其中酶聯免疫法程序簡單，分析速度快，檢測成本低，但考慮到樣品復雜的基質體系，易出現假陽性或假陰性，從而造成誤判或漏判，僅作為初篩方法被應用；而液相色譜法雖然定量結果準確度高，但靈敏度相對較低，對復雜基質條件中低含量待測物質的定性存在一定困難；氣質聯用法需要使用N,O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)[11]等衍生試劑進行衍生化處理，步驟較為繁瑣；超高效液相色譜-質譜聯用法具有分析時間短、確證能力強、靈敏度高、抗干擾能力強等優點，已逐漸成為分析測試的重要手段之一，將其應用于食品中β-受體激動劑的檢測具有重要的現實意義。

由于β-受體激動劑在畜禽產品中與葡萄糖醛酸、硫酸酯蛋白等成分相結合[12]，有機溶劑直接浸提法可以較好的提取游離態的β-受體激動劑，但不能將結合態目標物提取出來，也就不能準確反映樣品中待測物質的實際含量，因此須將結合態的β-受體激動劑轉化為游離態再進行檢測。目前的研究主要集中在酸法水解[15]和酶法水解[16]，酸水解較為劇烈，且水解隨意性大，水解后產物眾多，可能增加測定時的基質干擾。而酶水解過程相對溫和，由于酶具有專一性的特點，在合適的酶解條件下酶解樣品既能使結合態的β-受體激動劑轉化為游離態，又可以盡量避免產生過多的酶解產物干擾測定。目前我國相關質檢機構在畜禽產品中β-受體激動劑質量安全專項中較多使用的是《農業部1025號公告-18-2008》方法[16]，該方法需加酶酶解16h將結合的β-受體激動劑釋放出來，檢測過程耗費時間較長，對監督和執法等工作帶來了滯后性和不便性，因此需要進一步研究酶解的最佳作用條件，并建立超高效液相色譜-質譜聯用檢測方法，在準確定性、定量測定目標物的前提下縮短前處理和分析時間，以適應快速檢測的發展趨勢。本實驗擬優化提取豬肉中β-受體激動劑的酶解條件，建立豬肉中9種β-受體激動劑殘留的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，為豬肉樣品中9種β-受體激動劑的快速確證和定量分析提供方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉購買于湛江市農貿市場；特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、非諾特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、噴布特羅、妥布特羅，沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6及克倫特羅-D9(色譜純，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈(色譜純，美國Spectrum公司)；乙酸銨(色譜純，美國DIMA公司)；甲酸(色譜純，Merck公司)； β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(100000 U/mL， Merck公司)；高氯酸、乙酸乙酯及異丙醇(分析純)；Oasis?MCX固相萃取柱(3 mL/60 mg，美國 Waters公司)；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

ACQΜITY UPLCTM-TQD超高效液相色譜-串聯質譜(配有電噴霧離子源(ESI)及Masslynx數據處理軟件，美國Waters公司)；T25高速均質機、MS3 渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-QA10 超純水儀(美國Millipore公司)；CR22GⅢ 離心機(日本HITACHI公司)；E120H超聲波儀(德國Elma公司)；SWB-2000恒溫水浴搖床(天津奧特賽恩斯公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

單標儲備液：分別準確稱取特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、非諾特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、噴布特羅、妥布特羅標準品10 mg，用甲醇超聲溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL的單標儲備溶液， -18℃避光保存。

混合標準中間液：分別準確吸取9種單標貯備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，配制成1.0 μg/mL的混合標準中間液。

混合內標工作液：分別吸取適量沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9標準溶液，用甲醇配成100 ng/mL的混合內標液。

1.3.2 標準曲線溶液的配制

吸取混合標準中間液和混合內標工作液適量，配制成9種β-受體激動劑質量濃度分別為0.25、1、2、5、10 μg/L的系列標準工作溶液，其中3種內標的質量濃度均為1 ng/mL，依次進樣10 μL，并繪制標準工作曲線。

1.3.3 樣品預處理1.3.3.1 樣品前處理

將購買回的豬肉去脂肪，取瘦肉部分充分絞碎，備用。

1.3.3.2 樣品的酶解

稱取2 g絞碎樣品于50 mL塑料離心管中，加入8 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH為5.2)，8000 r/min高速勻漿30 s，再加入適量β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，放置在37 ℃水浴搖床恒溫振蕩適當時間。

1.3.3.3 樣品的提取

酶解到達預定時間后取出，放置至室溫并充分渦旋，5000 r/min離心8 min，吸取上清液，加入內標工作液及0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，充分渦旋混合，用高氯酸調節溶液pH值為1.0±0.2，以8000 r/min高速離心8 min去除沉淀，移取上清液并用10 mol/L和1 mol/L的氫氧化鈉溶液調pH至11。加入10 mL飽和氯化鈉溶液，用10 mL異丙醇-乙酸乙酯(6:4)溶液提取兩次，渦旋混勻10 min，8000 r/min離心8 min后取有機相置于40 ℃水浴下氮氣吹干。吹干后的殘留物用5 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH為5.2)，超聲溶解備用。

1.3.3.4 樣品的凈化

Oasis?MCX固相萃取柱先用2 mL甲醇、2 mL去離子水活化。取上述提取液全部過柱，再依次用2 mL去離子水、2mL 2%甲酸溶液淋洗，真空泵負壓下抽干，用5%氨水甲醇溶液2.5 mL洗脫，洗脫液在40 ℃水浴下氮氣吹干。殘渣用1.0 mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液(5:95,v/v)溶解，超聲混勻后全部轉移至2 mL離心管中，15000 r/min高速離心8 min，取上清液經0.2 μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 色譜及質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A(乙腈)-B(0.1%甲酸水溶液)；流速：0.3 mL/min ；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。梯度洗脫：0 min～2 min，維持5%的A；2 min～10 min， 5%的A線性變化到60%A；10 min～12 min，60%的A線性變化到5%A；12 min～13 min，維持5%的A。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子模式；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：750 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；掃描方式：多反應監測(MRM)。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

采用電噴霧電離源，分別將質量濃度為0.5 μg/mL的β-受體激動劑單標標準溶液注入質譜儀進行全掃描，找出準確的[M+H]+峰，并以其為母離子進行轟擊獲得二次碎裂產生的碎片離子，分別找出2個信號較強的碎片離子與母離子組成監測離子對，并分別對錐孔電壓、碰撞能量等參數進行優化。優化獲得的多反應監測模式離子對及質譜條件見表1。

2.2 色譜條件的選擇

采用超高效液相色譜儀和ACQUITY UPLC BEH C18柱對樣品進行分離，在流動相的選擇上比較了甲醇-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5mmol/L乙酸銨溶液對目標物質的分離效果。結果表明3種流動相均可以分離9種β-受體激動劑，但使用乙腈-0.1%甲酸水溶液能更好分離待測組分，而且色譜柱的柱壓更低，各色譜峰的信噪比更高，峰形更好，因此選擇用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。比較乙腈含量從2%～60%的出峰時間和分離效果，優化了流動相梯度洗脫的程序，確定流動相初始濃度為乙腈-0.1%甲酸水溶液(5/95,v/v)，在此梯度洗脫條件下出峰時間合適，峰形好，9種β-受體激動劑的MRM色譜圖見圖1。

表1 β-受體激動劑測定的質譜條件

注：*為定量離子

2.3 酶解條件的選擇

動物體在吸收β-受體激動劑，經過代謝后大多數會與硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用，以硫酸軛合物和葡萄糖醛酸軛合物等結合態形式存在，因此需要將其轉化為游離態進行檢測。采用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶對豬肉樣品進行酶解，以9種β-受體激動劑的總峰面積為指標，考察了在37℃，pH=5.2的條件下β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶的添加量和酶解時間對β-受體激動劑殘留測定結果的影響(圖2，圖3)。

從圖2和圖3可以看出，隨著酶添加量的增加和酶解時間的延長，9種β-受體激動劑的總峰面積呈現先增加后降低的規律，在分別對9種β-受體激動劑峰面積進行分析后發現這主要是由于非諾特羅和噴布特羅兩種成分峰面積降低所致。一方面，在酶解的前期隨著酶加量和酶解時間的延長，呈結合態的β-受體激動劑被釋放出來，各待測組分的測定值均增加。但另一方面，隨著酶解的深入，酶解的產物增多，基質組分變得更加復雜，可能對非諾特羅和噴布特羅產生較大基質抑制效應，使得其測定值降低。因此，在37℃和pH=5.2的條件下，每克豬肉樣品中β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酶的適宜添加量為2500U，酶解時間為6.0h。

圖1 優化條件下β-受體激動劑的MRM色譜圖(進樣體積為10μL，濃度為5μg/L)

圖2 酶添加量對9種β-受體激動劑總峰面積的影響(37℃，pH=5.2，酶解8.0h)

圖3 酶解時間對9種β-受體激動劑總峰面積的影響(37℃，pH=5.2，每克樣品酶加量為2500U)

2.4 方法的線性范圍和檢出限

在優化的色譜和質譜條件下考察了9種β-受體激動劑的線性關系。以目標化合物質量濃度與相應內標物質量濃度的比值為橫坐標，目標化合物定量離子峰面積與相應內標物峰面積的比值為縱坐標，繪制待測物質標準曲線(表2)。由表2可見，9種β-受體激動劑在0.25～10 μg/L質量濃度范圍內均有良好的線性關系。采用空白樣品基質加標的方法，以S/N≥3時目標物的含量為該方法的檢出限，以S/N≥10時目標物的含量為該方法的定量限。經計算本方法測定9種β-受體激動劑的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。

表2 9種β-受體激動劑的線性回歸方程和相關系數

2.5 方法的回收率和精密度

在空白豬肉樣品中添加標準溶液進行添加回收率實驗，添加水平分別為0.5、1.0、5.0 μg/kg，每個添加水平進行6次重復實驗，加標回收率和精密度結果見表3。從表3可以看出，9種β-受體激動劑的回收率在80.4%～110.3%之間，相對標準偏差≤6.7%。

3 結 論

本研究優化了提取豬肉中9種β-受體激動劑的酶解條件，并建立了同時測定豬肉中9種β-受體激動劑的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。在37℃和pH=5.2時，β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶的最佳酶解條件為每克豬肉中酶添加量為2500 U，酶解時間為6.0 h。9種β-受體激動劑以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進行分析，樣品運行時間為13 min即可獲得滿意的分離效果。采用內標法定量，在添加水平分別為0.5、1.0、5.0 μg/kg的條件下9種β-受體激動劑的回收率在80.4%～110.3%之間，相對標準偏差≤6.7%。該方法的樣品前處理時間和上機分析時間較短，且靈敏度高，回收率和重現性等均能滿足定量分析要求，結果準確可靠。適于豬肉中特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、非諾特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、噴布特羅、妥布特羅標的同時測定，尤其適合大批量樣品的快速確證和定量分析。

表3 空白樣品中β-受體激動劑的添加回收率及相對標準偏差(n=6)

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