茶葉中阿維菌素和吡蟲啉殘留量的測(cè)定

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湛江524001)

1 前言

吡蟲啉(imidacloprid)又叫滅蟲精，是新一代硝基亞甲基類內(nèi)吸殺蟲劑[1]，具有廣譜、高效、低毒、低殘留，害蟲不易產(chǎn)生抗性，并有觸殺、胃毒和內(nèi)吸多重藥效。吡蟲啉近年在我國(guó)茶葉種植生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛,主要用以防治小綠葉蟬、黑刺粉虱等刺吸式口器害蟲。阿維菌素(abamectin)是由放線菌產(chǎn)生的一種安全、高效、廣譜的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[2,3]，廣泛用于蔥、西蘭花、甘藍(lán)等出口蔬菜和茶葉上。在14、25和35℃下吡蟲啉在油菜葉面消解的半衰期分別為8.7、3.8和2.9天[4]，推薦使用劑量、2倍推薦使用劑量和4倍推薦使用劑量使用后阿維菌素在廣州小白菜中的半衰期為1～2d[5]。按世界衛(wèi)生組織(WHO)的5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，阿維菌素屬于高毒化合物。歐盟法規(guī)(EC)規(guī)定了茶葉中阿維菌素和吡蟲啉的最大殘留限量(MRL)分別為0.02 mg /kg和0.05mg /kg，日本則不允許將阿維菌素用于茶葉種植中，日本肯定列表中茶葉中的限量標(biāo)準(zhǔn)為10 mg/kg。然而，隨著我國(guó)茶葉出口量逐年增長(zhǎng)，為應(yīng)對(duì)國(guó)際貿(mào)易壁壘，急需建立同時(shí)檢測(cè)吡蟲啉和阿維菌素的高靈敏度方法。

目前，食品中吡蟲啉的測(cè)定方法的主要有液相色譜法[6-10]和氣質(zhì)譜聯(lián)用法[11]，阿維菌素的測(cè)定方法主要是高效液相色譜熒光法[12,13]和高效液相色譜紫外法[14,15]。以往的方法靈敏度低，無(wú)法跟國(guó)際接軌。本方法的建立旨在建立一個(gè)同時(shí)測(cè)定茶葉中吡蟲啉和阿維菌素的測(cè)定方法。目標(biāo)物經(jīng)乙腈提取，氨基炭黑柱凈化，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法同時(shí)測(cè)茶葉中吡蟲啉和阿維菌素的殘留量。方法靈敏度高，分析速度快。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQUITY UPLCTM-TQD MS/MS系統(tǒng)(美國(guó)waters)；高速勻質(zhì)機(jī)(德國(guó)IKA)；氮吹儀(美國(guó)Organomation)；離心機(jī)(日本日立)；漩渦混合器(德國(guó)IKA)；電子天平(FA1104，上海天平儀器廠)等。

阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品；吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品(95%)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；乙腈(分析純)；固相萃取小柱：氨基炭黑柱(500 mg/6 mL)；水為二次蒸餾水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱量50.0 mg阿維菌素和吡蟲啉原藥于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇(色譜純)溶解并定容，配制成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取阿維菌素和吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋配制成5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)液相色譜測(cè)定后建立兩種目標(biāo)物濃度與峰面積的回歸方程。

2.4 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：UPLC ACQUITY BEH，50×2.1 mm，1.7 μm；采用乙腈和0.005 mol/L乙酸銨溶液梯度洗脫，洗脫程0～1 min,20%A;1～4 min,90%A;4～5 min,100%A;5～7 min,20%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃ ；進(jìn)樣量：10 μL離子源：ESI，正離子模式；毛細(xì)管電壓：4.0 kV ；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/ hr；錐孔反吹氣流量50 L/ hr；錐孔電壓：40 v；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子對(duì)：吡蟲啉，256/175.1(定量離子對(duì))，256/209；阿維菌素，890.5/305.2(定量離子對(duì))，890.5/567.3。

2.5 分析步驟

2.5.1 提取

準(zhǔn)確稱取2.5 g(精確至0.01 g)均勻試樣，用5 mL水將試樣潤(rùn)濕，放置5 min,加入5 g無(wú)水硫酸鈉和15 mL乙腈，渦動(dòng)3 min，超聲5 min，5000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。用10 mL乙腈再提取一次，合并提取液。將提取液于50 ℃水浴下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，在殘?jiān)屑尤?.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液，備用。

2.5.2 凈化

將炭黑氨基柱用4.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)預(yù)條件化，加入上述待凈化溶液，用10 mL具塞試管收集，用2.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)洗濃縮瓶后淋洗小柱，重復(fù)一次。將收集溶液置于50 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?.0 mL乙腈溶解，在漩渦混合器上混勻，過0.2 μm微孔水相濾膜后于高效液相色譜測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 工作曲線

用流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500ng/mL，以峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。阿維菌素和吡蟲啉的相關(guān)系數(shù)分別為R=0．9991和R=0．9985，回歸方程分別為y=2632x+1033和y=8150x+229，在5 ng/mL～500 ng/mL范圍內(nèi)，阿維菌素和吡蟲啉工作曲線線性良好，適合定量分析。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液離子流圖見圖1和圖2。

圖1 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流圖

圖2 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流圖

3.2 液相色譜、質(zhì)譜測(cè)定條件的優(yōu)化

阿維菌素和吡蟲啉的極性較弱，在反相色譜柱上的保留較強(qiáng)，因此選擇較高比例的乙腈作為強(qiáng)洗脫溶劑。母離子掃描顯示：阿維菌素和吡蟲啉在正離子模式下，目標(biāo)物檢測(cè)離子以[M+NH4]+形式存在的量較多，在流動(dòng)相中加入5 mmol/ L乙酸銨可促進(jìn)母離子的形成。兩種化合物的保留時(shí)間、定量離子、定性離子、錐孔電壓及碰撞能量見表1。

表1 各目標(biāo)化合物的檢測(cè)離子及質(zhì)譜采集參數(shù)

3.3 凈化條件的選擇

由于茶葉中色素含量較高，所以選取了可以有效吸附色素的色譜柱。結(jié)果表明，炭黑氨基柱可以很好的吸附色素和其他雜質(zhì)，同時(shí)，選用合適的洗脫液完全可以將兩種化合物洗脫，從而獲得較高的添加回收率。普通的氨基柱也可獲得較高的添加回收率，但由于不能吸附提取液中的色素，從而增加了對(duì)分析柱的污染及對(duì)儀器響應(yīng)的干擾，而選用堿性氧化鋁柱和C18 SPE柱時(shí)不論選擇哪種淋洗劑，回收率均小于60%。所以最終選用炭黑氨基柱。淋洗液選用甲醇和二氯甲烷，對(duì)二者比例進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)甲醇和二氯甲烷的比例在1∶99到5∶95之間，回收率均能滿足要求，當(dāng)甲醇和二氯甲烷的比例為5∶95時(shí)，回收率達(dá)到最大值。

3.4 檢出限

聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)與世界衛(wèi)生組織(WHO)均未制定最高允許殘留限量，加拿大和澳大利亞規(guī)定油菜籽中最高殘留限量為0.05 mg/kg。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO)所屬的食品中農(nóng)藥殘留立法委員會(huì)(CCRPF)規(guī)定了阿維菌素的每日允許攝入量0.1 μg/kg·bw，阿維菌素的最高殘留限量(MRL)為5 μg/kg，美國(guó)農(nóng)業(yè)部下屬的食品安全檢驗(yàn)局(FSIS)規(guī)定的MRL值為20 μg/kg，歐盟規(guī)定MRL值為0.02 mg/kg。加拿大衛(wèi)生部發(fā)布EMRL2012-45號(hào)通報(bào)，有害生物管理局修訂了吡蟲啉的最大殘留限量。將吡蟲啉在蛋、豬、馬、牛、綿羊、山羊、家禽的脂肪、肉以及肉副產(chǎn)品中的最大殘留限量修訂為0.02×10-6，將吡蟲啉在干黃豆和奶類中的最大殘留限量分別修訂為3.5×10-6和0.03×10-6。本方法的最低檢出限為0.001 mg/kg，完全適合于進(jìn)出口農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素和吡蟲啉的殘留檢測(cè)。

3.5 方法的準(zhǔn)確度與精確度

用上述試驗(yàn)方法，在樣品中添加不同水平的阿維菌素和吡蟲啉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，分別進(jìn)行了5 μg/kg、20 μg/kg和100 μg/kg三個(gè)添加水平的兩種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。從表2可以看出，平均回收率范圍為81.4%～95.8%，RSD分別為2.0%～8.5%。

3.6 應(yīng)用

該方法已應(yīng)用于茶葉中阿維菌素類藥物殘留的檢測(cè)。在對(duì)購(gòu)自湛江市場(chǎng)的5份綠茶、5 份紅茶、5份普洱茶的檢測(cè)中,只有其中一份綠茶檢測(cè)出10.4μg/kg的吡蟲啉。

4 結(jié)論

本文建立了茶葉中阿維菌素和吡蟲啉的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。通過對(duì)提取與凈化方式進(jìn)行探討與優(yōu)化,在一定程度上減少了茶葉基體對(duì)檢測(cè)的干擾。采用電噴霧電離源,在含有乙酸銨緩沖液的流動(dòng)相條件下,以選擇信號(hào)強(qiáng)且穩(wěn)定的[M+NH4+]加合離子峰作為母離子,以基質(zhì)校正曲線進(jìn)行定量。方法穩(wěn)定、可靠、靈敏,能夠滿足國(guó)內(nèi)外法規(guī)對(duì)茶葉中阿維菌素和吡蟲啉殘留的限量要求,可用于茶葉中阿維菌素和吡蟲啉兩種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)與確證。

表2 空白茶葉基質(zhì)中2種被測(cè)物的添加濃度、添加回收率與精密度(n = 6)

[1]何松濤，俞曄，乙小娟，等. 固相萃取-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定水果蔬菜中吡蟲啉、吡蟲清殘留量. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2006,16(3):49.

[2]《主要貿(mào)易國(guó)家和地區(qū)食品中農(nóng)獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》編委會(huì). 主要貿(mào)易國(guó)家和地區(qū)食品中農(nóng)獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn).北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004: 33,230.

[3]丘光,顧正遠(yuǎn),肖英芳.吡蟲啉對(duì)蚜蟲的防效. 農(nóng)藥,1995,34(8)：33.

[4]庾琴,秦曙,王霞等. 溫度、光照及生物因子對(duì)啶蟲脒和吡蟲啉在油菜葉面消解的影響.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2006,8(2):147-151.

[5]許美玲,王玲,徐樹蘭. 阿維菌素在廣州小白菜中的殘留消解動(dòng)態(tài). 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,37(4):131-132,141.

[6]GB/T 23379-2009 水果、蔬菜及茶葉中吡蟲啉殘留的測(cè)定 高效液相色譜法[S].

[7]NY/T 1275-2007 蔬菜、水果中吡蟲啉殘留量的測(cè)定[S].

[8]吳剛,吳云華,鮑曉霞,等.高效液相色譜法分析茶葉中吡蟲啉殘留量.理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2005,41(10):768-769.

[9]謝桂英,楊 潔,劭丹丹,等.小麥籽粒與土壤中吡蟲啉殘留測(cè)定.農(nóng)藥,2005,6(45):475-476.

[10]陳美艷,于晶,李昆同,等. 吡蟲啉在金銀花中的殘留動(dòng)態(tài)研究.藥物分析雜志,2008,28(3):421-423.

[11]劉永波,劉海山,王紅芳.固相萃取一氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定蔬菜、水果中吡蟲啉殘留量. 理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2007,43,1:23-25.

[12]王海,劉素英,單吉浩,等. 液相色譜法測(cè)定豬組織中阿維菌素類藥物殘留量[J]. 中國(guó)獸藥雜志,2005,39(9):12-15.

[13]周俊,喬坤云,馮婷,等. 牛、豬肉中伊維菌素殘留量的HPLC檢測(cè)與分析[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2005,(1):82-83.

[14]高國(guó)文.高效液相色譜法檢測(cè)大白菜中阿維菌素殘留量.農(nóng)藥科學(xué)與管理,2005,26(11):8-9.

[15]張少華,皇甫偉國(guó),何新華等.高效液相色譜法檢測(cè)蔥中阿維菌素的殘留量. 藥,2006,45(4):263-264.