膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制及在煙草上的應用

張愛民，張雙鳳，趙鋼勇，朱寶成，李淑娜

(1.河北農業大學 生命科學學院，河北 保定 071001；2.河北大學 生物技術中心，河北 保定 071002)

膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制及在煙草上的應用

張愛民1,2，張雙鳳2，趙鋼勇2，朱寶成1，李淑娜1

(1.河北農業大學 生命科學學院，河北 保定 071001；2.河北大學 生物技術中心，河北 保定 071002)

為研究膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對煙草品質的改善和產量的提高，通過自行分離的膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株的發酵、發酵液離心和后處理，研制出含菌量高達50.0×108/g的肥料制劑，并利用該肥料制劑在貴州煙草上進行了減少煙草專用肥的接種實驗.研究結果表明:每公頃施用該肥料制劑30 kg，能促進煙株生長發育，提高煙葉產量、產值、均價、上等煙葉率和中上等煙葉率，改善煙葉內在化學品質，大大提高煙葉質量等級，同時底施該肥料制劑，還可減少20%的基肥施用，降低成本投入，增加煙農的收益. 因此,該膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株在烤煙生產上具有一定的應用價值.

膠凍樣類芽孢桿菌；肥料制劑；田間實驗；煙草

硅酸鹽細菌是一類能分解硅酸鹽礦物的細菌的俗稱，1912年蘇聯學者亞歷山羅夫[1]首先從蚯蚓腸道中分離出一株細菌，發現其能分解長石、云母、土壤礦物等鋁硅酸鹽類的原生態礦物，使土壤中難溶性K，P，Si等轉變為可溶性物質供植物生長利用.1939年，研究人員直接從土壤中分離出這種細菌并命名為硅酸鹽細菌(Silicatebacterium)[2].Alexandrov也報道，從巖石材料中分離出一株產黏液的能分解硅酸鹽的細菌，并定名為膠質芽孢桿菌硅酸鹽亞種(Baci11usmuci1aginosussubsp.si1iceus),但限于當時的條件未對其作進一步研究.因此該種的分類地位長期以來未得到國際承認.

1993年，研究人員經過對芽孢桿菌屬51株菌種的16S rDNA序列測定和比較分析，將其分類命名為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)[3].類芽孢桿菌屬的菌株分布廣泛，可以從土壤、水和不同的植物根際和植物體內分離得到[4-5],該屬菌株的重要特點是大多產生具有拮抗作用二級代謝產物[6],膠凍樣類芽孢桿菌也歸為該屬.但是該菌株不僅具有以上特點，同時還具有解鉀、解磷、固氮等多種作用，在農業生產上的應用可以提高作物產量，改善農產品品質[7].

由于膠凍樣類芽孢桿菌能夠分解含鉀硅酸鹽礦物，因此以此菌株為主要活性成分俗稱為生物鉀肥的產品已在國內外被廣泛應用.中國20世紀50年代推廣使用的硅酸鹽細菌制劑(生物鉀肥)曾帶來了良好的增產效果.該菌株在原蘇聯也進行了廣泛研究.近年來，國內大量田間實驗表明生物鉀肥對各種喜鉀作物如甘薯、煙草、水稻等有明顯的增產作用[8-9].

硅酸鹽細菌菌劑一直采用傳統工藝制造，限制了該項技術的推廣和應用.本文采用新分離的膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株，通過發酵、離心和噴霧干燥工藝處理，并與草炭載體復配，研制出了含菌量高達50.0×108/g的肥料制劑.應用該制劑在中國煙草主產區貴州省的煙草上進行了大田對比實驗，實驗結果表明:施用該肥料制劑可減少傳統煙草種植模式專用肥的用量，并可提高煙草產量，改善煙草品質.

1 材料和方法

1.1供試菌種

膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株，河北農業大學農業微生物學研究室分離保藏.菌株分離自陜西小麥田.

1.2供試作物

煙草品種-云87，為貴州省目前主要栽培品種.

1.3培養基

1.3.1 斜面培養基(g/L)

酵母粉7.0，酵母膏0.7，蛋白凍10.0，糊精2.0，磷酸氫二鈉1.0，硫酸鋅0.2，硫酸鈣0.2，瓊脂20.0.

1.3.2 種子培養基(g/L)

蔗糖10.0，硫酸銨1.0，磷酸氫二鉀2.0，酵母膏0.4，硫酸錳2.0，醋酸鈣 1.0，三氯化鐵0.2，pH 7.0～7.2.

1.3.2 發酵培養基(g/L)

磷酸氫二鉀2.0，蔗糖20.0，硫酸錳2.0，硫酸銨0.8，醋酸鈣1.5，酵母膏0.5，pH 7.0～7.2.

1.4膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制

1.4.1 菌種的活化

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株保存菌種轉接至斜面培養基，30 ℃恒溫培養48 h.

1.4.2 種子培養

250 mL三角瓶中分裝種子培養基，121 ℃，30 min滅菌，冷卻至室溫后接種膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株菌種，恒溫搖床振蕩培養，培養條件：溫度30 ℃，轉速200 r/min，周期14～18 h.

種子含菌量的測定方法(血球計數板法)：取培養(發酵)到終點的培養液1.0 mL，加到含有9.0 mL無菌水的試管中，充分振蕩1 min，再按照同樣方法加到第2支試管中，充分振蕩1 min后，用滴管加到血球計數板計數室內，沉淀片刻后，在顯微鏡高倍鏡下數5個中方格的菌體數量計數，則培養液的含菌量按如下公式計算：

含菌量=(5個中方格菌數之和)÷5÷4×108/mL.

1.4.3 發酵實驗

用50 L全自動發酵罐進行實驗，培養基為發酵培養基，裝料系數為70 %，121 ℃滅菌 30 min，冷卻至室溫后，負壓法接種液體菌種.

發酵液含菌量的測定方法(活菌計數法)：分別吸取5.0 mL發酵液加入45 mL無菌水中，按體積比1∶10進行梯度稀釋，分別得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀釋度的菌懸液.然后每個樣品取3個連續適宜的稀釋度，用0.5 mL無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，均勻地涂布于檢測培養基平板上.每一稀釋度重復3次，同時以無菌水作空白對照，32 ℃培養 48 h，以出現20～300個菌落數的稀釋度的平板為計數標準，分別統計有效活菌數.

含菌量(/mL)=(3個平板菌落數之和)÷3×10×稀釋倍數.

1.4.4 CX-9菌株肥料制劑的制備及質量檢測[10]

將CX-9菌株3批次發酵的發酵液收集在一個容器中，稱重后離心，然后進行噴霧干燥.計數后與適量草炭混合，研制出高含菌量的肥料制劑.依據GB20287-2006《農用微生物菌劑》進行產品檢驗.

肥料制劑生物量的測定方法(平板計數法)：準確稱取10.0 g肥料制劑加入100 mL無菌水中，按體積比1∶10進行梯度稀釋，分別得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀釋度的菌懸液.然后每個樣品取3個連續適宜的稀釋度，用0.5 mL無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，均勻地涂布于檢測培養基平板上.每一稀釋度重復3次，同時以無菌水作空白對照， 32 ℃培養48 h，以出現20～300個菌落數的稀釋度的平板為計數標準，分別統計有效活菌數.

生物量(/g)=(3個平板菌落數之和)÷3×10×稀釋倍數.

1.5CX-9菌株肥料制劑在煙草上的應用效果

1.5.1 試驗地基本情況

試驗在貴州龍崗煙草綜合實驗區內進行，質地黏壤，有機質質量分數2.78%，pH值6.12，堿解氮38.52 mg/kg，速效磷32.82 mg/kg，速效鉀108.36 mg/kg，肥力中上等，前茬為水稻.

1.5.2 試驗設計

采用同田簡單對比設計，設2個處理，3次重復.實驗面積0.4 hm2，外設保護行.T(接種)：CX-9菌株肥料制劑+4/5常規烤煙專用基肥；CK(對照)：常規烤煙專用基肥(N,P2O5,K2O的質量分數分別為10%,15%,15%), 對照和接種的肥料用量見表1.接種方法為用打洞器移栽，將CX-9菌株肥料制劑和300 kg干細土混合均勻后放在打洞器底部均勻施到每株煙草穴底部，然后放上煙苗即可.煙草追肥肥料N,P2O5,K2O的質量分數分別為10%,10%,20%.種植密度為16 500株/hm2，行距110 cm，株距55 cm.

表1 各處理肥料用量

1.5.3 物候期的調查及觀測

觀察記載各處理烤煙的團棵期、現蕾期和打頂期；測定各處理在團棵期和旺長期的株高、莖圍、出葉數、最大葉長和葉寬；收獲時分別計產.

1.5.4 田間管理

起壟、施肥、移栽、病蟲害防治、中耕、培土上廂、打頂和采烤等按當地優質煙生產技術方案執行.

1.5.5 煙葉的化學成分分析

分別取各處理中部煙葉(C3F)和上部煙葉(B2F)進行化學成分分析.

2 結果與分析

2.1CX-9菌株肥料制劑的研制

2.1.1 菌種的活化和轉接

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株的保藏菌種轉接到斜面培養基上，30 ℃培養2 d，斜面表面變成白色，涂片后，在顯微鏡下觀察，菌體全部變成芽孢，4 ℃冰箱保存.

2.1.2 種子培養

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株轉接到種子培養基上，培養12～14 h，取樣鏡檢，菌體成對或單個排列，菌體粗壯，結晶紫染色均勻，pH 6.0～6.3.計數含菌量為2.4×108/mL.

2.1.3 發酵培養

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株種子培養液，以負壓法按7%接種量接種到50 L發酵罐中，培養條件為：溫度35～37 ℃，罐壓0.06 MPa，間歇攪拌，攪拌轉速為200 r/min，通風比為1∶(0.3～0.5)(隨時間而變化)，發酵周期36～40 h，并進行同步化驗分析，pH值采用在線pH電極測定，含菌量采用稀釋平板法測定，結果見表2.

表2 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株3批次發酵實驗結果

結果表明，膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株在50 L發酵罐發酵，3批次結果比較一致，平均含菌量達到7.8×108/mL，芽孢形成率在95%以上，發酵水平較高.

2.1.4 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的檢驗結果

將3批發酵液收集后離心，并進行噴霧干燥，測定芽孢菌粉的生物量為602.4×108/g，將菌粉和草炭按照質量比11∶1進行充分混合，研制出草炭為載體的膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑，按照GB20287-2006《農用微生物菌劑》所規定的方法進行相關項目的質量檢測，結果見表3.

表3 CX-9菌株肥料制劑的檢驗結果

從表3看出，采用草炭為載體制成的膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑成品的含菌量遠遠高于GB20287-2006《農用微生物菌劑》所規定的技術指標，說明本生產工藝流程生產的肥料制劑符合農業部微生物肥料質量標準所規定的的技術指標，肥料制劑的研制方法可行.

2.2膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑在煙草上的應用效果

2.2.1 各處理對烤煙生育期的影響

接種膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對烤煙生育期的影響不大，對照與接種處理的煙株均于5月8日移栽，6月10日進入團棵期，7月5日進入現蕾期，7月12日進入打頂期.

2.2.2 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對烤煙團棵期煙株農藝性狀的影響

煙草生長到團棵期時進行相關農藝性狀的調查和統計，結果見表4.

表4 各處理團棵期煙株農藝性狀比較

表中數據均為5株的平均值.n=4時，t0.05=7.709,t0.01=21.98.

從表4得知，接種膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的煙草株高較對照平均高0.4 cm，葉片數較對照平均多1.0片/株，莖圍較對照粗1.0 cm，葉面積較對照增加113.65 cm2.其中對構成煙草產量的主要因素株高和葉面積進行了生物統計，t株高=19.267>t0.05=7.709，說明接種(T)與對照(CK)間達到顯著性差異；t葉面積=23.947 7>t0.01=21.98 ，說明接種與對照間達到極顯著性差異. 因而烤煙施用該膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑，能促進煙株前期生長發育.

2.2.3 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對烤煙旺長期煙株農藝性狀的影響

煙株生長到旺長期時進行相關農藝性狀的調查和統計，結果見表5.

表5 旺長期各處理煙株農藝性狀比較

從表5看出，烤煙施用膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑后，烤煙的株高、葉片數、莖圍和最大葉葉面積均好于對照.煙株株高較對照多1.6 cm，煙株葉片數較對照多2.0片/株，莖圍較對照多0.7 cm. 其中對構成煙草產量的主要因素株高和葉面積進行了生物統計，t株高=19.267>t0.05=7.709，說明接種(T)與對照(CK)間株高達到顯著性差異；t葉面積=23.947>t0.01=21.98 ，說明接種與對照間葉面積達到及顯著性差異,為煙葉產量和品質的提高奠定了基礎.

2.2.4 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對烤煙產量和產值的影響

煙葉收獲后，進行產量和產值統計，并分析了上中等煙所占比例，結果見表6.

表6 不同處理對烤煙產值的影響

從表6可見，接種CX-9菌株肥料制劑煙葉產量為2 187 kg/hm2，較對照(CK)高147 kg/hm2， 煙葉產值較對照高4 711.5元/hm2， 煙葉均價、上等煙率和中上等煙率分別較對照(CK)高18元/kg、7.0%和8.3%. 因而煙草施用膠凍樣類芽孢桿菌肥料制劑可以提高煙草種植的經濟效益.

2.2.5 不同處理對煙葉化學成分的影響

煙葉收獲后，分別取C3F葉片和B2F葉片，送貴州省煙草所進行相關化學成分的分析測定，結果見表7.

表7 不同處理對煙葉化學成分的影響

煙葉的化學成分是煙葉香味風格和品質特性形成的物質基礎，煙葉香味風格是煙葉內在化學成分平衡的綜合體現[11]. 煙堿是影響煙葉品質的重要因素之一，優質煙葉要保證一定的煙堿含量[12]. 總氮質量分數一般為1.5%～3.5%，以2.5%最佳，適宜的氮堿質量比最好接近1.0. 還原糖對煙葉品質起平衡作用，一般要求質量分數為16%～22%[13].煙葉氯質量分數以0.3%～0.8%為宜[14-15]，煙葉含氯量增加，糖類代謝受阻，淀粉積累過多.

煙葉的內在質量是判斷煙葉質量好壞的主要依據，主要包括香氣、雜氣、吃味、勁頭、刺激性、濃度、余味等.根據國內優質煙葉的評價，質量好的煙葉樣品應還原糖含量較高，總氮含量較低，煙堿含量適中，K2O含量較高，兩糖差值小，蛋白質含量較低，糖堿比、鉀氯比、氮堿比均較高.

從還原糖上看，C3F處理(T)較對照高8.88%，B2F處理(T)較對照(CK)高1.39%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的還原糖含量均高于對照.

從總氮上看，C3F總氮處理(T)較對照低0.57%，B2F總氮處理(T)較對照(CK)低1.06%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的總氮含量均低于對照.

從煙堿含量上看，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的煙堿含量均有所降低，但比較適宜，符合優質煙葉的煙堿范圍.

從K2O含量上分析，C3F處理(T)較對照高0.56%，B2F處理(T)較對照(CK)高0.11%，因而施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的K2O含量均高于對照.

從糖堿質量比、鉀氯質量比和氮堿質量比上看，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的三者比值均比對照高，因而煙葉品質較好.

從以上5項優質煙葉的評價上看，施用CX-9肥料制劑可明顯提高煙葉的內在質量.

3 結論

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株進行發酵、離心及干燥處理研制出含菌量高達50.0×108/g的高生物量菌粉(肥料制劑)，高于GB20287-2006《農用微生物菌劑》所規定的技術指標，證明該生產工藝生產的肥料制劑路線可行.

在煙草上施用膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑，可減少20%的煙草專用基肥用量，盡管對烤煙進入各個生育期的時間影響差異不大，但能促進煙株生長發育，對提高煙葉產量、產值、均價、上等煙葉率和中上等煙葉率的作用明顯. 從還原糖上看，C3F處理(T)較對照高8.88%，B2F處理(T)較對照(CK)高1.39%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的還原糖含量均高于對照；從總氮上比較，C3F處理(T)較對照低0.57%，B2F處理(T)較對照(CK)低1.06%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的總氮含量均低于對照；從煙堿含量上看，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的煙堿含量均有所降低，但比較適宜，符合優質煙葉的煙堿范圍；從K2O含量上分析，C3F處理(T)較對照高0.56%，B2F處理(T)較對照(CK)高0.11%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的K2O含量均高于對照；從糖堿比、鉀氯比和氮堿比上分析，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的三者比值均比對照高，因而煙葉品質較好.從以上5項優質煙葉的評價上看，施用CX-9肥料制劑可明顯提高煙葉的內在質量.

該肥料制劑對于提高煙草品質的的作用機理有待進一步探討.

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ApplicationintobaccoandpreparationofthefertilizeragentofPaenibacillusmucilaginosusCX-9strain

ZHANGAimin1,2,ZHANGShuangfeng2,ZHAOGangyong2,ZHUBaocheng1,LIShuna1

(1.College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001,China;

2.Center of Biological Technology，Hebei University，Baoding 071002,China)

In order to study the improving of tobacco quality and increasing of tobacco yield byPaenibacillusmucilaginosusCX-9 strain, a kind of fertilizer agent has been produced. The fertilizer agent was get by fermentation, centrifugation and drying process ofP.mucilaginosusCX-9 strain and its biological amount can be reached to 50.0×108/g. The application experiments to reduce tobacco specific fertilizer were carried on in tobacco field in Guizhou province. As a result, with the application of 30 kg per hectare, the fertilizer agent had the ability of promoting tobacco plant growth, despite of this, the tobacco yield, production value, average price of tobacco leaf and rate of superior tobacco were promoted, and tobacco internal quality of chemistry were improved. Meanwhile, application of it could reduce tobacco basic fertilizer application 20%. So the costs of farmers could be reduced directly, and the income could be increased. Therefore, the application of fertilizer agent ofP.mucilaginosusCX-9 strain in tobacco planting have certain value-in-use.

Paenibacillusmucilaginosus; fertilizer agent; field experiments; tobacco

10.3969/j.issn.1000-1565.2013.04.010

2012-09-12

河北省科技支撐項目(06207125D-2)

張愛民(1967-)，男，河北武邑人，河北大學研究員,河北農業大學在讀博士，主要從事農業微生物及土壤修復劑的研究.E-mail:zhangam2008@yahoo.com.cn

Q93

A

1000-1565(2013)04-0387-07

(責任編輯趙藏賞)