HPLC波長切換法同時測定白術及其不同麩制品中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

吳 慧，趙文龍，單國順，賈天柱，2*

(1.遼寧中醫藥大學，遼寧大連 116600;2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧大連 116600)

白術為菊科Compositae植物白術Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，具有健脾益氣，燥濕利水，安胎的功效，臨床用于脾虛食少、腹脹泄瀉、水腫、自汗、胎動不安等癥［1］。白術的傳統炮制方法主要為麩炒法和土炒法［2-3］，2010年版《中國藥典》收載的是麩炒法［4］。白術的化學成分主要為揮發油，其中的倍半萜內酯類化合物白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ有抗炎、抗癌、促進胃腸運動等作用［5-8］。目前白術的麩炒品大多以白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅲ的量變化作為其麩炒后“增酯增效”［9］的評價標準，較少有文獻報道將白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量共同作為評價指標。為了較全面的反映白術生、制品的質量，本實驗利用波長切換色譜法［10］，同時測定白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量，進一步考察白術飲片及其炮制品的質量，以期更全面地反映白術生、制品的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC—10ATVP液相色譜儀(SPD—10AVP檢測器，LC-10atvp泵，AT-330柱溫箱);島津 LC—Solution色譜數據工作站;FA1004B電子天平(上海精密科學儀器有限公司);METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER公司);KQ—250DB型數控超聲波清洗器(超聲電功率250 W，頻率40 kHZ);規格篩(20、40、60目各一套);液化氣灶;鐵炒鍋。

1.2 藥材與試藥 麥麩(市售品，遼寧中醫藥大學炮制教研室提供);白術(購自浙江金華，經鑒定為白術Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖);對照品白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(購自四川省維克奇生物科技有限公司，批號111127，純度≥98%);甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 不同粒徑麥麩的制備［11］取樣品麥麩100 g，分別通過20、40、60目篩，即得＞20目、20～40目、40～60目、＜60目4種不同粒徑的麥麩。

2.2 不同含水量麥麩的制備 取樣品麥麩100 g，在105℃下烘干5 h［4］，平均分為4份，往每份麥麩中噴入定量清水，充分混勻，即得含水量為0%、10%(麥麩在正常環境下保存，含水量為10%左右)、20%、30%的麥麩。

2.3 蜜麩皮的制備［12］定量煉蜜置于預熱鍋內，加水(約為煉蜜量的1/4)稀釋后，將樣品麥麩倒入，乘熱拌勻，搓散，用文火炒至不黏手。每100 kg麥麩，用煉蜜60 kg。

2.4 麩炒白術［1］先將炒制容器用中火加熱至均勻撒入經上述處理的麥麩10 g，即刻煙起，隨之投入凈白術片100 g，不斷翻炒，至白術呈焦黃色，逸出香氣，取出，篩去麥麩，放涼。即得不同粒徑、不同含水量麥麩及蜜麩皮制白術。

2.5 清炒白術［13］取凈白術片100 g置于炒制的鐵鍋內，用中火加熱，不斷翻炒，至白術呈焦黃色，逸出香氣，取出，放涼，備用。

2.6 對照品溶液的制備 精密稱取白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品適量，置同一量瓶中，加甲醇配制成每1 mL含白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為0.256、0.102、0.216 mg的混合對照品溶液。

2.7 供試品溶液的制備 取白術藥材樣品適量，粉碎，過四號篩，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，再稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，靜置，取上清液過0.45μm濾膜，備用。

2.8 色譜條件

2.8.1 色譜條件的選擇 Diamonsil C18色譜柱(5μm，150 mm×4.6 mm);流動相為甲醇-水(60∶40);檢測波長，0～25 min(220 nm)，25～55 min(276 nm);柱溫30℃;體積流量 1.0 mL/min;進樣量20μL。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.8.2 測定波長的選擇 取少量白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品溶液，稀釋，置UV-3100型紫外分光光度計下掃描，結果白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ在220 nm處有最大吸收，白術內酯Ⅱ在276 nm處有最大吸收，故選擇在各自的最大吸收波長下作為高效液相色譜法的測定波長。

2.9 線性關系 精密吸取白術內酯混合對照品1、2、5、7.5、10、15μL進樣，按上述色譜條件測定，以峰面積分面積(mV)對進樣量(μL)進行線性回歸，得回歸方程為:白術內酯ⅠY=643362X+156568，r=0.9995;白術內酯ⅡY=430391X－607435，r=0.9996;白術內酯ⅢY=451708X－206502，r=0.9999。結果表明，白術內酯Ⅰ進樣量在0.256～3.840μg、白術內酯Ⅱ進樣量在0.102～1.530μg、白術內酯Ⅲ進樣量在0.216～3.240μg的范圍內線性關系良好。

2.10 精密度試驗 取同一對照品溶液，重復進樣6次，測定峰面積，白術內酯ⅠRSD=1.85%(n=6)，白術內酯ⅡRSD=1.27%(n=6)，白術內酯ⅢRSD=0.85%(n=6)。

2.11 穩定性試驗 將供試品溶液室溫下放置1、2、4、6、8、12 h，測定其峰面積，結果白術內酯ⅠRSD=1.92%(n=6)，白術內酯ⅡRSD=1.08%(n=6)，白術內酯ⅢRSD=0.86%(n=6)。

2.12 回收率試驗 精密稱取已知白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含有量的同一批樣品1 g，分別精密加入一定量的蒼術酮及白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品，按供試品溶液制備項下操作，平行操作6份，按上述色譜條件測定，計算回收率，白術內酯Ⅰ平均回收率為100.5%，RSD為2.0%;白術內酯Ⅱ平均回收率為100.1%，RSD為1.5%;白術內酯Ⅲ平均回收率為99.4%，RSD為1.9%。結果見表1。

2.13 樣品的測定 分別取生白術及其不同麩制品粉末，按照2.2項下方法制備供試品試液，分別精密吸取各供試品溶液20μL，注入高效液相色譜儀記錄峰面積，分別帶入標準曲線，計算樣品中各組分的質量分數，結果見表2。

表1 回收率測定結果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 生白術及其不同麩制品中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的測定結果(n=6)Tab.2 Determination results of atractylenolideⅠ、Ⅱ、Ⅲin Atractylodis macrocephalae Rhizoma and different kinds of Atractylodis macrocephalae Rhizoma fried with bran(n=6)

3 討論

3.1 波長切換應用于白術的定量測定中，能夠實現在同一色譜條件下，使其中有不同最大吸收波長的指標性成分能夠在各自的最大吸收波長處進行檢測，避免了干擾組分對待測物質測定的影響，變兩次測定為一次測定，簡化了白術測定的繁瑣步驟，該法具有快速、簡便的特點。

3.2 本實驗曾選用乙腈-水，甲醇-水等不同溶劑系統作為流動相進行洗脫，發現甲醇-水系統可獲得較好的峰形和合適的極性范圍。最終將流動相確定為甲醇-水(60∶40)，該條件下，白術中的白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ能得到良好的分離。

3.3 本實驗考察了不同的提取溶媒(甲醇、乙醇、丙酮等)、不同溶媒用量、不同提取方法(回流、索氏提取、超聲提取)、不同提取時間對測定結果的影響，最終確定提取方法為以10倍量甲醇作為提取溶劑，超聲提取30 min，該方法不需加熱，操作簡便，提取效果好。

3.4 實驗結果表明，白術經過不同粒徑、不同含水量的麥麩及蜜麩皮炒制后，白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量較生品及清炒品均有所上升，說明麩炒過程中輔料不可或缺，輔料麥麩對白術炒后“増酯增效”起著促進作用。同時發現，經不同的麥麩炮制后，白術中的內酯增量有所不同，其中＞20目麥麩、0%含水量麥麩及蜜麩皮炒制后的白術內酯量增加比較多，提示我們在麩炒時，輔料麥麩的某些性質(粒徑、含水量、是否蜜制等)可能會影響到中藥的內在質量。

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