花椒總生物堿抑菌作用

謝 輝，邵建明，王冠蕾

(承德石油高等專科學校化學工程系，河北承德 067000)

花椒(Zanthoxylum BungeanumMaxim)是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylumlinn)植物花椒或青椒的成熟干燥果皮，具有溫中助陽，散寒燥濕，行氣止痛，殺蟲止癢和抗氧調味的功能，是我國傳統調味料和中藥［1］。經測定花椒含有揮發油、生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、脂肪酸及黃酮等化學成分［2］。

目前對花椒提取物的藥理學活性研究主要集中在其揮發油和生物堿等方面，藥理實驗證明花椒揮發油具有較強的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、殺病菌和防霉菌作用，對農業害蟲小菜蛾、桃蚜和楊毒蛾等亦有防治效果［3－6］;花椒生物堿在抑制血小板凝集、抗瘧疾、鎮痛、止癢和抑制口腔致病菌等方面均顯示了一定生物活性［7］，這些研究暗示著花椒中化學成分在作為天然藥物、化妝品、食品添加劑和生物農藥等方面有著廣闊的應用前景。本文以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉為受試菌株，對花椒總生物堿的抑菌活性進行研究，以期進一步明確花椒生物堿的抗菌譜，為花椒在醫藥、食品防腐上的應用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉。

1.1.2 培養基

真菌培養基(馬鈴薯葡萄糖培養基):馬鈴薯浸出液200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

細菌培養基(牛肉膏蛋白胨培養基):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH7.2 ～7.5。

1.2 方法

1.2.1 花椒總生物堿的提取［8］

市售花椒粉碎后干燥至恒重，稱取粉末200 g，加入70%乙醇，料液比1∶10，用稀鹽酸調pH至3，60℃冷凝回流提取3 h。過濾后減壓回收乙醇，水提液用氨水調pH至9～10，再用氯仿萃取水層至水層對碘化鉍鉀反應呈陰性，合并氯仿液，減壓濃縮后常溫晾干得花椒總生物堿1.04 g，用20%甲醇水溶液超聲溶解配制成500 mg/mL的花椒總生物堿溶液，過濾除菌后4℃保存備用

1.2.2 濾紙片法測定抑菌圈直徑［9］

將活化培養的不同菌種制成菌懸液，然后加入0.2 mL菌懸液至冷卻的相應培養平板中，涂布均勻。將直徑6 mm濾紙片浸入500 mg/mL的花椒總生物堿溶液中稍晾干后放入培養皿，對照為浸入20%甲醇水溶液的濾紙片，使濾紙片與培養基完全接觸。供試菌種平行接種3個培養平板。所有平板置培養箱培養，細菌于37℃培養24 h，霉菌于28℃培養48 h，酵母于30℃培養24 h，取出觀察，游標卡尺測量抑菌圈的直徑(含濾紙片直徑)，求平均值。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定［10］

采用試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度，取若干滅菌試管，以適合菌種生長的液體培養基將花椒總生物堿溶液進行一系列對倍稀釋，濃度分別為 250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95 mg/mL，同時設空白對照和甲醇溶液對照。加入相應供試菌懸液0.05 mL至各試管。所有試管置培養箱培養，細菌于37℃培養24 h，霉菌于28℃培養48 h，酵母于30℃培養24 h，取出觀察判定結果，以含藥量低且肉眼觀察無可見菌生長的試管含藥量為藥物對該菌的MIC。

1.2.4 熱處理對花椒總生物堿抑菌活性的影響［9］

以大腸桿菌為指示菌，將500 mg/mL花椒總生物堿分別置40，60，80，100℃水浴和121℃濕熱條件下，熱處理30 min，對照置于25℃，用濾紙片法來測定其抑菌圈直徑，試驗重復3次。

2 結果

2.1 花椒總生物堿的抗菌譜

花椒總生物堿對供試菌種的抑制作用測定結果如表1所示，從表1中可以看出，花椒總生物堿對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉均具有一定的抑制效果;對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，對釀酒酵母和黑曲霉的抑制作用稍弱。

表1 花椒總生物堿的抑菌直徑

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定

花椒總生物堿對五種供試菌種的最小抑菌濃度測定結果如表2所示，從表2中可以看出，花椒總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.91 mg/mL，對枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度為7.81 mg/mL，對黑曲霉的最小抑菌濃度為15.63 mg/mL，對釀酒酵母的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL，這表明花椒總生物堿對細菌的抑制作用較強，對酵母的抑制效果相對較弱。

表2 花椒總生物堿對供試菌的最小抑菌濃度測定

2.3 熱處理對花椒生物堿抑菌活性的影響

以大腸桿菌為指示菌，測定不同溫度處理后花椒總生物堿的抑菌活性變化如圖1所示，由圖可知，花椒總生物堿經過不同溫度處理后，其對大腸桿菌的抑菌圈直徑變化不大，經過121℃濕熱處理后仍具有較高的抑菌活性，這表明花椒總生物堿的抑菌活性基本不受溫度的影響。

3 結論

借助濾紙片法，以抑菌圈直徑大小為評價標準，對花椒總生物堿的抑菌作用進行分析，結果顯示花椒總生物堿對細菌，釀酒酵母和黑曲霉具有抑菌作用，表明花椒總生物堿的抗菌譜較寬，花椒總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.91 mg/mL，對枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度為7.81 mg/mL，對黑曲霉的最小抑菌濃度為15.63 mg/mL，對釀酒酵母的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL。熱穩定性實驗表明花椒總生物堿的抑菌活性基本不受溫度的影響。

［1］ 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第四十三卷第二分冊［M］.北京:科學出版社，1997.

［2］ 畢君，曹福亮.花椒屬植物化學有效成分與開發利用研究進展［J］.林業科技開發，2008，22(3):9－13.

［3］ 崔俊，李孟樓.花椒開發利用研究進展［J］.林業科技開發，2008，22(2):9－14.

［4］ 干信，吳士筠，高雯琪.花椒揮發油抑菌作用研究［J］.食品科學，2009，30(21):128－130.

［5］ 趙媛.青花椒提取物對桃蚜和小菜蛾的生物活性研究［D］.石家莊:河北農業大學，2007.

［6］ 弭向輝.花椒揮發油的提取分離及其抗菌和抗腫瘤作用研究［D］.南京:南京師范大學，2004.

［7］ 石雪萍，關榮琴，張鳴鏑，等.花椒屬植物生物堿研究進展［J］.中國野生植物資源，2010，29(4):1－7.

［8］ 貝玉祥，董秀華，李干鵬，等.紫堇中總生物堿體外清除活性氧自由基及抗氧化作用研究［J］.食品科技，2008(4):189－191.

［9］ 江潔芳.花椒中抑菌活性成分提取工藝的研究［J］.中國調味品，2011，36(3):30－32.

［10］ 趙東亮，郁建平，周曉秋，等.博落回生物堿的抑菌作用研究［J］.食品科學2005，26(2):45－47.