血栓通粉針（三七總皂苷）對大鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl-2 蛋白表達的影響

蔣媛靜

（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530001）

腦缺血再灌注后腦損傷的發生可能與缺血再灌注后神經細胞生存環境發生變化，包括興奮性氨基酸、自由基、一氧化氮（NO）、Ca2+等，以及一些誘導凋亡的基因過度表達有關。Bcl-2 基因是第一個確認為能對抗細胞凋亡的基因［1-2］。本實驗旨在通過觀察血栓通粉針對腦缺血大鼠神經元凋亡相關基因Bcl-2 蛋白表達的影響，對腦缺血再灌注損傷與Bcl-2 蛋白的關系進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康Wistar 大鼠60 只，雌雄不分，體質量240～320 g（由廣西中醫藥研究所提供）。將60只大鼠隨機分成血栓通大劑量組（A 組）、血栓通小劑量組（B 組）、川芎嗪組（C 組）、模型組（D 組）、假手術組（E 組）5 組，每組12 只。造模前12 h 禁食。

1.2 藥品與試劑 Bcl-2 抗體、Bcl-2 免疫組織化學試劑盒，DAB 顯色試劑盒由北京中山生物技術研究所購，為Sigma 公司產品。血栓通粉針劑的主要成分為三七總皂苷，由廣西梧州制藥集團有限公司提供。川芎嗪注射液，由四川蜀樂藥業股份有限公司提供。

1.3 造模與給藥 A、B 組術前3 d 腹腔注射血栓通粉針，分別按10、5 mg/kg 劑量給藥。C 組術前3 d 腹腔注射川芎嗪注射液，按80 mg/kg 標準給藥，每日1次。D、E 組術前3 d 給予腹腔注射生理鹽水，每次2 mL。采用改良Longa 線栓法［4］制備大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）再灌注模型。大鼠水合氯醛麻醉后頸部正中做切口，分離左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，結扎頸外動脈及頸總動脈，在頸總動脈結扎遠端剪一小口，將制備好的5 cm 頭端浸蠟魚線沿頸總動脈插入至頸內動脈，頭端距頸外動脈分叉口約2 cm 魚線另一端暴露于縫合后的切口外并做標記，2 h 后拔出魚線2 cm，大鼠清醒后行Longa 5 分制神經功能評分，1～3 分者入選。剔除造模后煩躁、劇烈跳動及經解剖證實為蛛網膜下腔出血的大鼠。E 組大鼠僅給予剝離頸內動脈，不結扎血管；其余4 組大鼠建立大腦中動脈閉塞（MCAO）再灌注模型，各組于術前30 min 各給藥1次，術后6 h 再給藥1次。

1.4 標本采集與檢測

1.4.1 腦組織切片的制作 各組動物于手術后24 h取材。4%多聚甲醛心臟灌注固定、取腦備用。在4℃冰箱保存經4%多聚甲醛固定6～8 h，然后經10%及20%蔗糖梯度脫水后，將固定的標本用恒冷冰凍切片機將視交叉層面切成4 μm 厚的冠狀切片，貼附于涂有APES 膠的載玻片上。

1.4.2 免疫組化染色（SABC 法）腦組織經冰凍切片，封閉內源性過氧化物酶，羊血清處理后，加入抗Bcl-2 單抗，4℃過夜，依次滴加生物素化山羊抗小鼠IgG 及試劑SABC 20～37℃20 min，DAB 顯色后常規復染、脫水、透明、封片、觀察。光學顯微鏡選擇大鼠兩側海馬CA1段的神經元，以細胞質內出現鮮艷的棕黃色顆粒為陽性細胞，每張切片高倍鏡下5個不同的視野，計數每個視野內的陽性細胞占全部神經元的百分率，取平均值。用Image Pro Plus 圖像分析儀測量Bcl-2 蛋白表達的平均光密度值表示Bcl-2 蛋白染色強度。

1.4.3 HE 染色 冰凍切片，Harris 蘇木素液5 min，75%鹽酸乙醇分化30 s，酸化伊紅乙醇1～2 min，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.5 統計學處理 應用SPSS11.5 統計軟件。計量資料以表示，采用t 檢驗，方差齊性分析用F 檢驗；組間比較用q 檢驗和t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果 Bcl-2 免疫組化染色陽性細胞胞漿染成棕黃色，核染色較淺，多為膠質細胞，可見突起，神經元亦可見到胞漿或在核周染成棕黃色。E 組大鼠腦組織海馬區未見Bcl-2 陽性細胞表達，A 組和C 組海馬區可見Bcl-2 陽性細胞表達染色較深。D 組血栓通小劑量組見少量Bcl-2 表達。

2.2 Bcl-2 蛋白表達情況 見表1。缺血再灌注24 h后，D 組大鼠與E 組比較Bcl-2 蛋白陽性細胞數目增多（P＜0.05）；與D 組比較，A 組、C 組大鼠Bcl-2 蛋白陽性細胞數目明顯增多（P＜0.01）。與B 組比較，A 組Bcl-2 陽性細胞增高有顯著性（P＜0.05）。A 組與C 組比較未見明顯差異（P＞0.05）。D 組海馬CA1段Bcl-2蛋白表達光密度值顯著高于E 組，表明Bcl-2 蛋白表達量顯著高于E 組（P＜0.05）；與B 組比較，A 組光密度值增高（P＜0.05）。A 組、C 組海馬CA1段Bcl-2 蛋白表達光密度值高于B 組（P＜0.01），A 組與C 組之間比較無明顯差異（P＞0.05）。

表1 各組缺血再灌注24 h 大腦海馬區Bcl-2 蛋白表達率和表達光密度值（±s）

表1 各組缺血再灌注24 h 大腦海馬區Bcl-2 蛋白表達率和表達光密度值（±s）

與D 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。與B 組比較，▲P＜0.05；與E組比較，#P＜0.01。

2.3 組織形態學改變 HE 染色，光鏡下所見×40：E組大腦海馬各區，未明顯特殊病變，神經細胞未見體積增大、水腫變性、壞死改變。D 組大腦海馬各區，尤其是CA1區，見神經細胞腫脹，體積增大，胞漿淡染、疏松，核膜不清、碎裂、溶解，細胞數目減少。A 組神經細胞接近正常，胞漿稍疏松、淡染，體積稍大，未見神經壞死。B 組神經細胞尚腫脹，體積增大，胞漿淡染，但未見明顯壞死。C 組神經細胞稍腫脹，胞漿淡染，未見明顯神經細胞壞死。

3 討論

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡（PCD），其具有生理性和選擇性特征機體內環境發生改變，在各種信號刺激下，細胞通過不同的信息途徑導致其正常代謝方式關閉，啟動細胞凋亡代謝途徑，并在嚴格的基因控制下合成所需的特定蛋自酶［5］，激活內源性DNA 內切酶完成細胞自殺過程。研究表明，一些凋亡抑制劑如YVAD-FMK、zDEVD、FMK、zVAD.FMK、CrmA、凋亡抑制蛋白、Bcl-2 家族均可抑制細胞凋亡，縮小梗死體積，改善腦水腫，延長治療時間窗。神經生長因子的抗凋亡作用也已被確認。其中Bcl-2 基因是第一個確認為能對抗細胞凋亡的基因［1-2］。

本實驗結果表明，缺血30 min 再灌注24 h時存活腦細胞中有大量Bcl-2 表達，表達主要位于缺血周邊區，缺血中心區為壞死細胞?？梢哉J為，腦缺血再灌注能促使Bcl-2 表達，Bcl-2 蛋白參與腦缺血的自我保護過程。假手術組Bcl-2 散在微弱表達，推測是由于手術創傷刺激引起。血栓通大劑量組海馬區Bcl-2 表達高于缺血再灌注組的結果，表明大劑量血栓通能減少神經元的死亡，可保護Bcl-2 蛋白表達，抑制海馬神經元的凋亡。

血栓通粉針（三七總皂苷）除了促使Bcl-2 大量表達從而保護神經細胞外，還可能通過以下機制保護神經元。（1）鈣通道阻斷作用：降低缺血腦組織的總鈣含量，減輕缺血缺氧時腦細胞內Ca2+過負荷［6］。（2）抑制NO 含量：腦缺血再灌注期大量產生的NO 對神經細胞具有毒性作用，高濃度的NO 可抑制線粒體呼吸鏈，使能量衰竭；可介導其他毒性自由基的產生，引起膜損傷；抑制DNA的合成和修復及誘導細胞凋亡網。三七總皂苷可使腦組織NO 含量降低，而對NOS 活性無顯著影響。表明其抗腦缺血作用與其抑制NO的釋放，減輕NO的神經毒性有關［7］。（3）抗自由基作用：能使血中超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，而丙二醛（MDA）顯著減少，PNS 可以有效地保護內源性SOD 活性，抑制脂質過氧化反應，具有明顯的抗氧自由基作用［8］。（4）減輕腦水腫，改善血腦屏障通透性［9］。（5）降低興奮性氨基酸的毒性作用［10］。（6）能顯著降低TC，TG，LDLCH、全血黏度、血漿黏度、血細胞比容的作用，具有抑制大鼠血栓形成、抗缺血性腦損傷作用［11］。

本實驗表明，腦缺血時血栓通粉針（三七總皂苷）能顯著上調體內Bcl-2 表達，減輕缺血再灌注后神經細胞損傷，有望作為一種有效的神經保護劑應用于腦缺血疾病的治療。

［1］MattsonMP，etal.Am［J］.PhysiolCellPhysiol，2000，279（3）：852.

［2］Kaneda K，et al.Brain Res，1999，815（1）：130.

［3］Longa EZ，Weinstein PIL，Carlson S，et al.Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in Fats［J］.Stroke，1989，20：84.

［4］Garcia JH，Liu KF，Hok L.Neuronal necros is after middle cerebral artery occlusion in wister rat progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex［J］.Stroke，1995，26（4）：636.

［5］史以菊，吳俊芳，夏作理，等.三七總皂苷對大鼠局灶性腦缺血的保護作用［J］.中國臨床藥理學與治療學，1999，4（4）：272-275.

［6］唐映紅，黃小平，譚華，等.三七總皂苷對腦缺血再灌注后細胞外基質破壞及氧化應激的影響［J］.中華中醫藥學刊，2010，28（11）：2327-2330.

［7］簡道林，余金甫，黃海波，等.三七總皂苷對缺血-再灌注兔保護作用機制的研究［J］.中國危重病急救醫學，1999，3（3）：145-147.

［8］Liu Jian Hui.Effect of PNS on brain blood flowing and brainblood baffier with cerebral ischemial［J］.Apoplexy and Nervous disease，2002，19（3）：164.

［9］劉建輝，冀鳳云.三七總皂苷對缺血再灌注鼠腦組織Ca2+和興奮性氨基酸的影響［J］.中國臨床藥理學與治療學，2002，7（1）：33-34.

［10］李珊.三七總皂苷治療高脂血癥療效研究［J］.遼寧中醫藥大學學報，2011，13（5）：175-176.