龜象膏大鼠皮膚長期毒性實驗研究※

高銀輝 梁海英 王智慧

(河北省樂亭縣醫院藥劑科，河北 樂亭 063600)

龜象膏是河北省唐山市豐潤區中醫醫院根據臨床需要研制出的用于治療糖尿病足的制劑[1]，其主要成分為龜版、象皮、白及、黃連、地龍、車前子、升藥、煅石膏等。為考察其安全性，我們參照新藥審批辦法中有關毒理學實驗技術要求及有關文獻，進行了該藥的皮膚長期毒性實驗研究，為其臨床應用和進一步研究開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠154只，體質量200～250 g，雌雄各半，由河南省實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(豫)2005～0001。每只分籠飼養，基礎飼料為實驗鼠全價顆粒飼料，飲用水為已潔凈消毒的水，籠底墊料為已經潔凈消毒的鋸末，每2 d更換1次。實驗室溫度21～24 ℃，濕度55%～70%，光照12 h明暗周期。

1.1.2 實驗儀器 Biofuge strutos型高速低溫離心機(Kendro Laboratory Products)；JY92-2D型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所)；YKH-Ⅰ型液體快速混合器(江西醫療器械廠)；TU-180 紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；RE-52AA型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；FA2104N型普通電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；PTHW型電熱套(鞏義市英峪予華儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械股份有限公司-醫療器械五廠)；予華SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；CELL-DYN3700全自動五分類血球分析儀(日本光電)；HITACHI7060全自動生化分析儀(日本東芝公司)。

1.1.3 實驗藥物 龜象膏，藥物組成：龜版100 g，象皮粉60 g，白及粉60 g，黃連粉36 g，地龍粉30 g，車前子粉30 g，升藥2 g，煅石膏18 g，芝麻油500 g。制備方法：龜版和芝麻油慢火熬12 h，龜版微枯后，細絹濾清復入杓內煎滾納入白及粉、黃連粉至白及粉變為淡黃色，微火加入地龍粉及車前子粉，微火熬制，撈除殘渣，濾過，油液備用，煅石膏、升藥采用等量遞增法，將升藥混入煅石膏中，取羊毛脂50 g，加入上述藥油內溶化，待溫度降至40～50 ℃時加入象皮粉、升藥及煅石膏的混合粉，再加入凡士林適量備用。實驗對照品為乳膏賦形劑凡士林。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將154只SD大鼠隨機分為7組，即空白對照組，完整皮膚高、中、低劑量組及破損皮膚高、中、低劑量組，每組各22只，雌雄各半。

1.2.2 給藥方法 各組大鼠背部脊柱兩側剃毛，面積約4 cm2，破損皮膚高、中、低劑量組大鼠用針頭在剃毛區皮膚劃井字，深淺以滲血為度，造成破損皮膚。完整皮膚不予任何處理。完整皮膚、破損皮膚高劑量組在剃毛區涂龜象膏20 g/(只·d)，中劑量組涂龜象膏10 g/(只·d)，低劑量組涂龜象膏5 g/(只·d)，空白對照組涂乳膏賦形劑凡士林10 g/(只·d)。涂藥后用膠布固定，每日1次，連續90 d(每周停藥1 d)。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 給藥期和恢復期(停藥14 d)內逐日觀察各組大鼠外觀、行為體征、活動、精神狀態、進食、糞便及尿液等情況。每7 d稱體質量1次，計算給藥前后體質量增減率[體質量增減率=(給藥后體質量-給藥前體質量)/給藥前體質量×100%]。如有中毒反應，如嘔吐、排泄物異常及皮膚膿腫病變等，則重點觀察，發現死亡或瀕死者及時尸檢。給藥90 d后，每組取14只大鼠(雌雄各半)用戊巴比妥鈉麻醉后，心臟采血，檢測血常規及血液生化指標，隨后做系統尸檢及病理檢查。各組剩余大鼠在停藥14 d后同法處理。

1.3.2 血液學指標 采用心臟采集動脈血方法，收集血液，檢測各組大鼠血紅蛋白(Hgb)、紅細胞計數(RBC)、白細胞計數(WBC)及白細胞分類(包括中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞及嗜酸粒細胞)主要血液學指標。

1.3.3 血液生化指標 在做血液學指標的同時，收集血液，分離血清，檢測尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)及血清總膽紅素(TBiL)主要生化指標，并進行麝香草酚濁度實驗(TTT)。

1.3.4 系統尸檢及病理檢查 大鼠放血處死后，立即對主要臟器做視觀剖檢，觀察主要臟器及腺體是否有肉眼可見腫大、縮小、色澤及硬度等病變。并取心、肝、脾、肺、腎分別稱質量，計算臟器系數[臟器系數=(臟器質量/大鼠體質量)×100%]。完整皮膚高劑量組、破損皮膚高劑量組及空白對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胸腺、甲狀腺、子宮、卵巢、睪丸、附睪、直腸、十二指腸、胃及皮膚做病理切片檢查。

2 結 果

2.1 一般情況 給藥期及恢復期各組大鼠外觀、行為體征、活動、精神狀態均無明顯異常；飲食、糞便及尿液正常，體質量正常增加；無大鼠死亡情況發生，亦無中毒反應。提示龜象膏對正常大鼠及皮膚破損大鼠正常生活無明顯影響。

2.2 各組大鼠主要血液學指標比較 見表1。

表1 各組大鼠主要血液學指標比較 ±s

由表1可見，各組大鼠主要血液學指標之間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠主要生化指標比較 見表2。

表2 各組大鼠主要生化指標比較 ±s

由表2可見，各組大鼠之間AST、ALT、TBiL、TTT及BUN比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠給藥前后體質量增減率比較 見表3。

表3 各組大鼠給藥前后體質量增減率比較 ±s

由表3可見，各組大鼠體質量增減率之間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠主要臟器解剖及病理組織學檢查 各組大鼠主要臟器心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、睪丸、子宮等肉眼觀察其位置、形態、色澤、硬度等均無明顯腫大、縮小、色澤、硬度等異常病變情況。完整皮膚高劑量組、破損皮膚高劑量組及空白對照組動物心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胸腺、甲狀腺、子宮、卵巢、睪丸、附睪、直腸、十二指腸、胃及皮膚病理檢查結果均無異常。

2.6 各組大鼠主要臟器系數比較 見表4。

表4 各組大鼠主要臟器系數比較 %，±s

由表4可見，各組大鼠主要臟器系數比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

糖尿病合并肢端特別是足部壞死性病變稱為糖尿病足(壞疽)，是糖尿病致殘性并發癥之一。導致糖尿病足的原因有肢端中小血管循環和周圍神經病變，引起局部缺血、缺氧及營養功能障礙，加上局部擠壓、摩擦、碰撞、皮膚干燥破裂，或合并細菌感染等諸多因素。由于患者對該病缺乏認識，治療措施不當，病變常在短期內加劇，甚者需行截肢或因合并敗血癥而死亡[2]。目前，西醫綜合治療效果不盡人意。糖尿病足屬中醫學消渴、脫疽等范疇。中醫學認為，濕、毒、熱、瘀、虛為其基本病理因素。主要由于寒、濕、毒邪侵淫，氣血凝滯，經脈阻滯，或肝腎不足，四肢氣血不充，失于濡養而致足(指)焦黑壞死，甚則脫落。臨床采用中醫藥療法能取得較好療效，且無明顯不良反應[3]。

龜象膏具有潤濕、祛腐生肌、解毒、活血通絡之效，能對創面深、濕度差、血運差、肉芽生長緩慢的難治性創面起到保濕、促進肉芽生長、加速創面愈合的作用，能快速控制炎癥，迅速修復筋膜，提高保肢率，降低致死率，為糖尿病足的治療提供了一條新思路。龜象膏中龜版滋陰養血；象皮止血斂瘡，收斂護膚；白及收斂止血，消腫生肌，助龜版潤濕；黃連清熱解毒，與龜版配伍，清內外諸火；地龍、車前子有清熱結、利水道之效；升藥、煅石膏提膿祛腐。諸藥合用，共奏潤濕、化腐生肌、解毒、活血通絡之效。現代藥理研究表明，象皮主要成分為蛋白質、氨基酸及微量元素，可以促進表皮細胞的增生、分化，使傷口的pH值變化過程加快，促進傷口愈合[4]；龜版含角質蛋白、脂肪及鈣、磷動物膠，局部應用有營養組織細胞、潤濕作用，促進肉芽和組織細胞生長[5]。

為能安全地在臨床上使用，本實驗測定龜象膏長期連續經皮膚給藥對實驗大鼠的長期毒性，并設置了完整皮膚和破損皮膚組進行實驗。完整皮膚主要用于監測藥物對大鼠皮膚刺激的敏感性，破損皮膚主要用于監測藥物對大鼠皮膚創面愈合的治療作用[6]。本實驗依據長期毒性的實驗時間應為臨床療程的2～3倍的原則，最長為3個月[7]，確定本實驗連續給藥時間為90 d。用龜象膏以高、中、低劑量，分別給予大鼠完整皮膚及破損皮膚，每日1次，連續90 d。在給藥期及恢復期內大鼠的一般狀況良好，體質量增加，主要血液學指標、生化學指標等均屬正常范圍，與空白對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。解剖主要臟器，肉眼未見明顯改變，病理報告未見病理性病變。表明龜象膏長期連續經皮膚給藥對實驗大鼠無毒性反應。說明龜象膏在臨床劑量下使用是安全的，可初步推斷適當延長治療時間或適當加大給藥量亦不會影響其安全性。

[1] 王智慧，趙紅心，谷小芳.龜象膏治療糖尿病肢端壞疽40例療效觀察[J].河北中醫，2009，31(11)：1623-1624.

[2] 張振濤.中西醫結合治療糖尿病肢端壞疽的體會[J].中國中醫藥現代遠程教育，2008，6(4)：351.

[3] 鄧秀娟.淺談中醫藥治療糖尿病肢端壞疽[J].中國中醫藥信息雜志，2006，13(1)：92.

[4] 李鋆，李秀蘭，張燕玲，等.象皮與擬替代品黃牛皮、水牛皮中蛋白的研究[J].中草藥，2007，38(11)：1656-1658.

[5] 汪祿祥，董寶生，劉家富.藥用龜板的氨基酸和礦質元素分析[J].廣東微量元素科學，2005，12(11)：42-44.

[6] 李太一，申成華，鄭善子，等.藜蘆乳膏的皮膚毒性實驗研究[J].延邊大學醫學學報，2004，2(27)：118-120.

[7] 賈春蓉，陳如泉.半硫丸藥物組成毒性實驗研究[J].河北中醫，2009，31(8)：1225-1226.