納他霉素對青皮核桃保鮮的影響*

郭園園，魯曉翔，李江闊，梁冰，郭興月，陳紹慧，張鵬

1(天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津，300134)

2(國家農產品保鮮工程技術研究中心，天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津，300384)

3(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽，110866)

核桃(Juglans regiaL.)又稱胡桃、羌桃。核桃種仁富含蛋白質、磷脂、維生素、礦物質及人體必需的不飽和脂肪酸等營養物質，具有滋養腦細胞，增強腦功能，防止動脈硬化，降低膽固醇等作用［1］。近年來，鮮食核桃因其營養豐富、口感良好、相對較低的脂肪含量等，在國內外越來越受到人們的喜愛［2］。但青皮核桃采后呼吸旺盛，貯藏時極易腐爛，影響其市場供應期［3］。因此，青皮核桃的保鮮技術亟待解決。

目前，利用保鮮劑保鮮青皮核桃的研究尚未見報道。納他霉素是一種天然保鮮劑，安全性高，且具有廣譜高效的抗真菌作用［4］。據報道［5－6］，納他霉素在低濃度下就能有效抑制真菌生長，對幾乎所有的真菌類都有很強的抑制性，已在香菇、乳制品、肉制品、果汁飲料、葡萄酒保藏上得到應用，效果較好。本實驗利用納他霉素對青皮核桃進行處理，研究其對青皮核桃品質變化的影響，以探討青皮核桃的貯藏保鮮提供新的技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料:2012年9月2日采自北京平谷縣核桃實驗園基地，選取大小均勻、無機械損傷、無病蟲害的青皮核桃供實驗用。

主要試劑:納他霉素，北京東方瑞德生物技術公司;三氯乙酸(分析純)，天津市江天化工技術有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(均為分析純)，天津市科威有限公司;鄰苯二酚(為分析純)，天津市光復精細化工研究所;PVP、DTT(均為分析純)，天津博美科生物技術有限公司;亞油酸鈉、Tri tonX-100(生化試劑)，天津博美科生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

冷庫:國家農產品保鮮工程技術研究中心(天津)(以下簡稱保鮮中心)，庫內溫度 －0.5～0.5℃;CW-700d分光測色計，柯尼卡美能達(中國)投資有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;SIGMA 3－30K高速離心機，德國SIGMA實驗室離心機公司;微孔保鮮袋(厚度0.02 mm)由保鮮中心提供。

1.3 實驗材料預處理

(1)對照組(CK):將選取的青皮核桃于冷庫［(0±0.5)℃］中進行預冷處理，充分預冷24 h后，用微孔袋(厚度0.02 mm)包裝后放入紙箱，繼續冷藏。

(2)處理組1(SY1):將選取的青皮核桃在質量分數為600 mg∕L的納他霉素中浸泡3 min，瀝干后于冷庫［(0±0.5)℃］中預冷24h后，用微孔袋(厚度0.02 mm)包裝后放入紙箱，繼續冷藏。

(3)處理組2(SY2):將選取的青皮核桃在質量分數為800 mg∕L的納他霉素中浸泡3 min，余下步驟同SY1處。

(4)處理組3(SY3):將選取的青皮核桃在質量分數為1 000 mg∕L的納他霉素中浸泡3 min，余下步驟同SY1處。

上述各處理組按10 kg/箱包裝，且每隔15d測定一次各項指標，每個處理各進行3次重復測定。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 霉腐率

霉腐率/%=(霉爛果個數/處理的總果數)×100

1.4.2 色差的測定

隨機取5個青皮核桃用CW－700 d分光測色計測定。測定時在果實對稱的位置用記號筆標記，每隔15 d對標記點進行測定，并取平均值。a*為負值，表示綠色。

1.4.3 丙二醛(MDA)含量測定

采用硫代巴比妥酸比色法［7］。

1.4.4 多酚氧化酶(PPO)

采用兒茶酚比色法［8］。

稱取核桃仁凍樣3 g于預冷的研缽中，加入適量0.05 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液(總用量20 mL)，冰浴研磨成勻漿，于4℃下15 000 r/min離心10 min，再取上清液于4℃下10 000 r/min離心10 min。取3 mL上清酶液，然后加入3.9 mL pH 7.8磷酸緩沖液，1.0 mL 0.1 mol/L兒茶酚，于37℃水浴保溫10 min，迅速放入冰浴中，立即加入2mL體積分數20﹪三氯乙酸終止反應，于420 nm處測其吸光度值，以磷酸緩沖液代替酶液為對照調零。

1.4.5 過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法［9］

稱取核桃仁凍樣0.2 g于預冷的研缽中，加入20 mL預冷后的pH 7.5、0.05 mol/L的磷酸緩沖液(內含0.005 mol/L二硫蘇糖醇和2%PVP)，在冰浴中研磨成勻漿，于4℃下15 000 r/min離心 20 min，取0.05 mL粗酶液，加入3 mL 0.02 mol/L H2O2后，在240 nm處測定2 min內樣品的吸光度變化。

1.4.6 脂氧合酶(LOX)參考陳昆松［10］的方法測定

稱取核桃仁凍樣1.0 g，冰浴研磨，加入0.05mol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)，并使最終體積為20 mL，于4℃下15 000 r/min離心30 min，上清液為LOX的提取液。加入亞油酸鈉25 μL，pH 7.0磷酸緩沖液2.775mL，30℃溫育，加 200 μL 酶液后 20 s開始計時，記錄234 nm處測定1 min內吸光度，重復3次。

以上酶活性計算公式均為:

式中:X為酶的比活力(0.01ΔA/［g(FW)min］;△A為反應時間內吸光度的變化;D為稀釋倍數即提取的總酶液為反應系統內酶液體積的倍數;t為反應時間/min;m為稱取果肉質量/g。

1.4.7 數據處理

所有數據采用 Excel 2003軟件處理，并采用SPSS16.0軟件的新復極差法(Duncan)進行方差分析(P=0.05)和多重比較。

2 結果與分析

2.1 納他霉素對青皮核桃霉腐率的影響

圖1表明，各組核桃的霉腐率隨貯藏期的延長而增加。CK到貯藏60 d后霉腐率迅速增加，而各處理組在75d時霉腐率才大幅增加，而此時CK的霉腐率已達到48.18%，果實嚴重腐爛、發霉，已失去商品價值;而處理組在貯藏75d時的霉腐率依 SY1、SY2、SY3分別為23.69%、9.75%、6.73%。在整個貯藏期，霉腐率大小順序為CK＞SY1＞SY2＞SY3。從貯藏第15天開始，CK的青皮核桃霉腐率顯著(P＜0.05)高于處理組;SY3的霉腐率略低于SY2，但極顯著(P＜0.01)低于SY1。由此可知，納他霉素處理組有效地抑制了青皮核桃的霉變及腐爛，能更好地保持青皮核桃的品質，其中以SY3的防霉效果最好。

圖1 納他霉素對青皮核桃霉腐率的影響Fig.1 Effect of natamycin on decay rate of green juglans

2.2 納他霉素對青皮核桃色差的影響

青皮核桃果皮色澤是評價其外觀品質的重要指標。通常，青皮核桃的果皮在貯藏開始時為綠色，隨著貯藏時間的延長，果皮逐漸變黃，最后變為黑褐色。本試驗以色差計對青皮核桃的果皮色澤變化進行跟蹤監測，其中a*正值表示偏紅，負值表示偏綠。a*值越小則表明顏色越綠。實驗結果如圖2所示。

由圖2可見，各組a*隨著貯藏時間的延長均呈上升趨勢，但各組青皮核桃的a*在貯藏前期差異并不明顯。至貯藏30 d，各組a*開始迅速增大。在貯藏60 d時，CK組的a*值達到4.39，極顯著(P＜0.01)高于處理組，但各處理組間無顯著差異。至貯藏后期，各組青皮核桃的a*變化趨于緩慢。在整個貯藏過程中，各組a*的大小順序為CK＞SY1＞SY2＞SY3。可知，納他霉素處理組能夠有效抑制a*值的增加，較好保持青皮核桃的色澤，其中以SY3的保色效果最好。

圖2 納他霉素對青皮核桃a*的影響Fig.2 Effect of natamycin on a*of green juglans

2.3 納他霉素對青皮核桃MDA的影響

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的主要產物之一，其含量的增加是膜脂過氧化加強，膜受傷而加劇衰老的表現，它反映了果實在逆境下受傷害的程度［11］。

圖3 納他霉素對青皮核桃MDA含量的影響Fig.3 Effect of natamycin on MDA content of green juglans

圖3顯示，各組的MDA含量的變化均為先增后降的趨勢，且有雙峰曲線。各組在貯藏15d時均出現第 1 個高峰，CK、SY1、SY2、SY3 的峰值分別為5.39%、5.18%、4.47%、4.06%，可能是因為青皮核桃對低溫的應對反應所致;之后由于青皮核桃適應了貯藏溫度，而使MDA含量逐漸降低。貯藏60d時出現第2個高峰，則可能是因為貯藏后期青皮核桃衰老的原因所致。在貯藏75d時，CK的MDA含量略高于SY1和SY2，SY3的MDA含量極顯著(P＜0.01)低于其他各組。可見，處理組能夠降低MDA含量，其中，SY3延緩青皮核桃衰老的效果最好。

2.4 納他霉素對青皮核桃多酚氧化酶(PPO)活性的影響

PPO含量增加能夠氧化酚類物質造成酶促褐變，從而降低酚類物質的抗氧化能力［12］。

圖4 納他霉素對青皮核桃PPO比活力的影響Fig.4 Effect of natamycin on PPO activity of green juglans

由圖4可見，CK的PPO比活力出現先降后升的趨勢，處理組則呈波浪式變化。貯藏初期各組青皮核桃的PPO比活力均下降，可能是低溫環境降低果實的代謝速率，抑制褐變發生。在貯藏30d，各處理組均出現了峰值，CK的PPO活性略高于處理組，而CK則未出現PPO活性高峰，可能是由于納他霉素加強了核桃仁應對環境的能力，因而之后的PPO比活力略有下降。在貯藏75d時，CK的PPO比活力迅速增大，各處理組也再次均出現峰值，可能是青皮核桃的品質急劇下降，衰老加速所致，此時CK的PPO比活力為12.067 0.01ΔA/［g(FW)·min］，極顯著(P＜0.01)高于 SY1(11.05 0.01ΔA/［g(FW)·min］、SY2(10.46 0.01ΔA/［g(FW)· min］、SY3(10.22 0.01ΔA/［g(FW)·min］。在整個貯藏期中，CK 的PPO比活力均高于處理組，SY3的PPO比活力均低于SY1、SY2。可見，SY3處理能夠有效地降低核桃PPO比活力，延緩其衰老。

2.5 納他霉素對青皮核桃過氧化氫酶(CAT)活性的影響

CAT能減少果實內的H2O2積累，從而延緩果實衰老。圖5結果顯示，各組的CAT活性均呈先增后降的趨勢，CK呈單峰曲線，在貯藏45d出現CAT活性高峰(7410.98{0.01ΔA/［g(FW)·min］};而處理組呈雙峰趨勢，在貯藏15d和45d均有高峰，由此看出，納他霉素處理誘導了CAT活性高峰的出現。在貯藏15d，CK的CAT酶活性僅為4 963.79{0.01ΔA/［g(FW)·min］}，極顯著(P＜0.01)低于各處理組的 CAT 活 性 (6323.53、7187.23、7829.36{0.01ΔA/［g(FW)·min］}。在貯藏45 d 時，SY3 的CAT 酶活性(9 215.61{0.01ΔA/［g(FW)·min］}顯著(P＜0.05)高于其它組，但其他組之間并無明顯差異。在整個貯藏期，CK的CAT比活力低于處理組，SY3的CAT的酶活性均高于SY1、SY2。結果表明，納他霉素處理組能有效地提高CAT比活力，其中以SY3的效果最佳。

圖5 納他霉素對青皮核桃CAT比活力的影響Fig.5 Effect of natamycin on CAT activity of green juglans

2.6 納他霉素對青皮核桃脂氧合酶(LOX)活性的影響

LOX以細胞膜釋放的游離脂肪酸為底物，催化形成氫過氧化物、自由基和茉莉酸(JA)等促進衰老的物質，故其直接或間接地參與組織的衰老進程［13］。

圖6 納他霉素對青皮核桃LOX比活力的影響Fig.6 Effect of natamycin on LOX activity of green juglans

如圖6所示，各組的LOX的比活力的變化趨勢均為先增后降再增的雙峰曲線。在貯藏15d時出現第一個峰值，此時 CK的峰值(54.51{0.01ΔA/［g(FW)·min］}略高于各處理組的峰值。在貯藏60d時，各組均出現第二個高峰，此時CK的LOX比活力(64.48{0.01ΔA/［g(FW)· min］}均高于 SY1(54.48{0.01ΔA/［g(FW)· min］}、SY2(54.53{0.01ΔA/［g(FW)·min］}、SY3(44.53{0.01ΔA/［g(FW)·min］}。這可能是由于青皮核桃的品質急劇下降，衰老加速所致。在整個貯藏期中，CK的LOX活力高于各處理組的LOX活力，而SY3的LOX比活力低于SY1與SY2。說明SY3處理能有效降低LOX活性，延緩衰老。

3 討論

3.1 納他霉素對青皮核桃品質的影響

納他霉素是目前國內外唯一的抗真菌防腐劑，是一種天然、廣譜、高效安全的酵母菌及霉菌等絲狀真菌抑制劑，它不僅能夠抑制真菌，還能防止真菌毒素的產生。有關納他霉素在青皮核桃的應用目前尚未見報道。Zhou［14］研究發現，對紅地球葡萄進行納他霉素處理，可有效地降低呼吸強度、失重率、腐爛率和落粒率。周翠英［15］研究發現，納他霉素處理可有效控制草莓果實表面霉菌數量，減慢葉柄葉綠素含量下降的速率，抑制果實有機酸與糖分的下降，較好地維持果實的營養，延長貯藏期。本文實驗表明，納他霉素可以降低青皮核桃的霉腐率與a*值的升高，能夠延緩MDA含量的增加，其中以1 000 mg/L納他霉素處理效果最好。

3.2 納他霉素處理對青皮核桃PPO、CAT和LOX活性的調控

CAT屬于抗氧化酶，能及時清除活性氧，保持膜結構完整，與果實的成熟及衰老有關。有研究表明，當植物受到病原菌侵害時，CAT的活性升高，抗氧化性加強、木質素合成、次生代謝加快，以抵抗病原菌的侵染［16］，CAT在木質素生物合成的最后一步反應過程中催化H2O2分解而發揮作用［17］，有效延緩了果實衰老。本實驗納他霉素處理促進了CAT活性，從而提升了青皮核桃對病原菌的抵抗能力。

PPO是存在于植物體內與抵抗病原微生物浸染有關的酶［18］。PPO在酶促褐變中起重要作用，PPO含量增加能夠氧化酚類物質造成酶促褐變，降低酚類物質的抗氧化能力。本實驗中的納他霉素處理抑制了青皮核桃的PPO活性，從而延緩其衰老。

LOX與果實的成熟衰老密切相關，LOX啟動膜脂過氧化作用，使膜磷脂不斷水解，產生游離脂肪酸。研究表明，LOX在植物的生長、發育、成熟衰老以及機械傷害、病蟲侵染等過程起調節作用［19］。本實驗納他霉素處理抑制了核桃LOX活性，這可能是納他霉素的抗菌性抑制了核桃LOX的活性。

本實驗結果表明，納他霉素處理能夠有效控制青皮核桃霉腐率的增加，較好的保持青皮核桃的原有色澤，延緩MDA含量的增加，提高CAT活性，降低PPO和LOX活性。其中，以1 000 mg/L納他霉素處理的青皮核桃的保鮮效果最佳。

［1］ 馬惠玲，宋淑亞，馬艷萍，等.自發氣調包裝對核桃青果的保鮮效應［J］.農業工程學報，2012，28(2):262－267.

［2］ 黃凱，袁德保，韓忠.鮮食核桃貯藏中生理生化變化的研究［J］.安徽農業科學，2008，36(23):9 858－9 860.

［3］ 魯墨森，張倩，楊娟俠.鮮食核桃保鮮和周年供應技術研究［J］.山東農業科學，2010(3):81－83.

［4］ Tianjia Jianga，Lifang Fenga，Xiaolin Zhenga al.Physicochemical responses and microbial characteristics of shiitake mushroom(Lentinus edodes)to gum arabic coating enriched with natamycin during storage［J］.Food Chemistry，2013，138(2/3):1992 －1997.

［5］ DSM.Natamycin in fermented sausages and cheese［J］.Food Engineering and Ingredients，2002，(9):39.

［6］ PedersenJ C.Natamycin as a fungicide internedia［J］.Applied and Environmental Microbiology，1992，(58):1 064－1 066.

［7］ Rao M V，Paliyath G，Ormrod D P.Ultraviolet-B-andozone-induced biochemieal changes in Antioxidant enzymes of Arabidopsis thaliana［J］.Plant Physiol，1996，110:125－136.

［8］ 朱廣廉，鐘誨文，張愛琴，等.植物生理學實驗［M］.北京:北京大學出版社，1990:37－40.

［9］ 李合生，孫群，趙世杰，等.植物生理生化實驗原理和技術［M］.北京:高等教育出版社，2000:39－43.

［10］ 陳昆松，徐昌杰，徐文平，等.獼猴桃和桃果實脂氧合酶活性測定方法的建立［J］.果蔬學報，2003，20(6):436－438.

［11］ 武菊英，滕文軍，王慶海，等.多年生觀賞草在北京地區的生長狀況與觀賞價值評價［J］.園藝學報，2006，33(5):1 145－1 148.

［12］ 張平，張鵬，劉輝，等.不同低溫處理對櫻桃冷害發生的影響［J］.食品科學，2012，33(12):303－308.

［13］ 許文平，陳昆松，徐昌杰，等.猴桃采后果實冷藏與貨架期脂氧合酶活性和乙烯生成的變化［J］.中國農業學，2003，36(10):1 196－1 201.

［14］ Zhou Huiling，Liu Meiying，Ren Xiaolin.Antisepsis and fresh-keeping effects of natamycin coating compounds treatment on red global grape［J］.Agricultural Science ＆Technology，2012，13(9):2 012－2 016，2036.

［15］ 周翠英，周建儉，高騰，等.納他霉素在氣調保鮮草莓中的應用研究［J］.食品科技，2012，37(3):54－57.

［16］ 劉美迎，周會玲，吳主蓮，等.納他霉素復合涂膜劑對葡萄保鮮效果的影響［J］.農業工程學報，2012，28(10):259－266.

［17］ Mónica Quirogaa，Silvia M.de Forchettia，Edith Taleisnika，et al.Tomato root peroxidase isoenzymes:kinetic studies of the coniferyl alcohol peroxidase activity，immunological properties and role in response to salt stress［J］.Journal of Plant Physiology，2001，158(8):1 007－1 013.

［18］ Ahl-goy P，Felix G，Metraux J P，et al.Resistance to disease in the hybrid Nicotiana glutinosa×Nicotiana debneyi is associated with high constitutive levels of β-1，3-glucanase，chitinase，peroxidase and polyphenoloxidase［J］.Physiol Mol Plant Pathol，1992，(41):11 －21.

［19］ 陳昆松，張上隆.脂氧合酶與果實的成熟衰老［J］.園藝學報，1998，25(4):338－344.