清利活血湯配合三黃生肌紗條對(duì)糖尿病潰瘍大鼠肉芽組織中白介素1、內(nèi)皮素1及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子含量的影響

段旭東 張雅蘭 趙 輝 高 璇 王曉媛 (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中醫(yī)外科，河北 石家莊 050000)

糖尿病足(DF)是糖尿病患者主要的慢性合并疾病之一，其病程長(zhǎng)、治療難度大、花費(fèi)高昂，目前普遍認(rèn)為DF是一個(gè)全身性疾病，它既有內(nèi)科疾病的臨床表現(xiàn)，又有肢端潰爛，局部感染等外科疾病的癥狀和體征，所以在其治療上，要重視內(nèi)外科綜合治療〔1〕。我科采用清利活血湯配合三黃生肌紗條治療糖尿病足多年，取得了良好的臨床療效。為探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了DF動(dòng)物模型，并初步觀察了二者對(duì)糖尿病潰瘍大鼠肉芽組織中白介素1(IL-1)、內(nèi)皮素1(ET-1)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠32只，全部雄性，體重180～220 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):1103043，室溫20℃飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.2 藥物

1.2.1 清利活血湯 黃芪20 g，山藥15 g，當(dāng)歸12 g，桃仁9 g，紅花 9 g，川芎 9 g，山楂 6 g，生地 9 g，玄參 20 g，蒼術(shù) 9 g，銀花12 g，黃連 6 g，土元 6 g，魚腥草 15 g，上藥加水 1 000 ml，浸泡2 h，武火煮開，文火煎煮15 min，將藥液倒出，加水500 ml，煎煮15 min，將藥液倒出與第一次藥液混合，使用前分別濃縮成含2.42 g生藥/ml的混懸液。冷藏保存。三黃生肌紗條:黃連、黃柏、姜黃、當(dāng)歸各15 g，生地30 g等，麻油500 g浸藥3 d，微火煎熬至藥枯，去藥渣后加入黃蠟30 g，微火化開，浸入滅菌紗布條，低溫儲(chǔ)存待用。

1.2.2 鹽酸二甲雙胍片 北京中惠藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字 H19983069，批號(hào)20101112，0.25 g/片。

1.3 主要儀器及試劑 高壓液相分析，VARIANT-2美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，MK3，芬蘭雷勃公司產(chǎn)品。全自動(dòng)洗板機(jī)8×12，美國(guó)寶特公司產(chǎn)品。電熱恒溫水箱，600型，天津泰斯特公司產(chǎn)品。離心機(jī)，TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。循環(huán)水真空泵，SHB-D，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。γ-放射免疫計(jì)數(shù)器，F(xiàn)J-2021，西安二六二廠，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)DY89-1寧波新芝生物科技股份有限公司。立式低溫冷藏箱，DW-40L262青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司。高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)，DL-CJ-1N哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。電子天平HM-200日本。bFGF酶聯(lián)免疫組化染色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。鏈脲佐菌素(STZ)，sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)S-0130。IL-1、ET-1放免試劑盒，北京301醫(yī)院放免所產(chǎn)品，批號(hào)20110525。

1.4 動(dòng)物分組及用藥 Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為DF模型組、正常組、清利活血湯治療組(治療組)、二甲雙胍治療對(duì)照組(對(duì)照組)，每組8只。治療組及對(duì)照組均從模型建立后第1天開始灌胃給藥2 ml，每日1次，共用藥15 d，用藥劑量按有關(guān)公式，將成人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量，模型組、正常組均以2 ml生理鹽水替代藥物每日1次灌胃，共15 d。各組大鼠均從手術(shù)后第1天起，每日清創(chuàng)1次，祛除創(chuàng)面上硬痂，常規(guī)消毒，用生理鹽水沖洗創(chuàng)面。治療組以三黃生肌紗條外敷，對(duì)照組用凡士林紗條外敷，正常組、模型組以生理鹽水紗條外敷。創(chuàng)面外用無(wú)菌紗布包扎，膠布固定。

1.5 模型建立 32只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，隨機(jī)抽取1組為正常對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)，余組高脂飼料喂養(yǎng)，4 w后禁食(不禁水)16 h，一次性腹腔注射低劑量STZ 30 mg/kg(用pH4.4的無(wú)菌枸櫞酸緩沖液配成0.25%濃度);正常對(duì)照組腹腔注射等體積的0.1 mol/L無(wú)菌枸櫞酸緩沖液，72 h后斷尾取血，測(cè)定血糖，血糖＞16.65 mmol/L者成為成模大鼠，隨機(jī)選取糖尿病大鼠按照血糖隨機(jī)分為糖尿病模型組、治療組、對(duì)照組。每組8只。4組動(dòng)物在空腹8 h后均以10%水合氯醛1 ml/100 g體重腹腔注射麻醉，背部剃毛，常規(guī)消毒，用打孔器于大鼠背部脊柱左側(cè)相同部位打孔(φ2 cm)，潰瘍深及筋膜層，止血后以無(wú)菌紗布包扎，分籠飼養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食，用藥期間所有糖尿病大鼠繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 糖化血紅蛋白(HbA1c)測(cè)定 10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉后，切斷大鼠右股動(dòng)脈取血，置EDTA抗凝管內(nèi)，采用高壓液相法測(cè)定。

1.6.2 IL-1、ET-1的測(cè)定 采用放射免疫法，分別取肉芽組織2 g生理鹽水沖洗3次，剪碎后移入高速勻漿器中，加入4℃生理鹽水4 ml，高速研磨2 min，使組織充分勻漿，制備好的勻漿置離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，提取上清液備用，測(cè)定時(shí)將樣品稀釋，取組織勻漿0.1 ml，先由自動(dòng)γ-放射免疫計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出標(biāo)準(zhǔn)曲線及濃度，然后測(cè)定IL-1、ET-1含量，并同時(shí)測(cè)得勻漿上清蛋白含量(g)進(jìn)行校正。

1.6.3 bFGF測(cè)定 采用免疫組化法半定量測(cè)定，石蠟切片常規(guī)脫蠟，微波抗原修復(fù)，加 3%H2O2去離子水 3 ml，孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗，3 min×3次，滴加封閉用正常山羊血清工作液3 ml，室溫孵育10～15 min，傾去，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃過(guò)夜，PBS沖洗3 min×3次，滴加生物素標(biāo)記山羊抗大鼠IgG，37℃孵育10～15 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加辣根標(biāo)記鏈霉卵蛋白工作液3 ml，37℃孵育10～15 min，顯色劑顯色，沖洗，封片。計(jì)算機(jī)圖像處理軟件半定量測(cè)定bFGF含量，以染色吸光度值表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠創(chuàng)面肉芽組織bFGF含量的變化 與正常組比較，模型組大鼠肉芽組織中bFGF含量明顯增高(P＜0.01)，與模型組比較，治療組及對(duì)照組bFGF均較模型組明顯降低(P＜0.01)，治療組bFGF較對(duì)照組低(P＜0.05)。見(jiàn)表1及圖1。

2.2 大鼠創(chuàng)面肉芽組織ET-1含量的變化 與正常組比較，模型組大鼠肉芽組織中ET-1含量明顯增高(P＜0.01)，與模型組比較，治療組及對(duì)照組ET-1均較模型組明顯降低(P＜0.01)，治療組ET-1較對(duì)照組低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 大鼠創(chuàng)面肉芽組織IL-1含量的變化 與正常組比較，模型組大鼠肉芽組織中IL-1含量明顯增高(P＜0.01)，與模型組比較，治療組及對(duì)照組IL-1均較模型組明顯降低(P＜0.01)，治療組ET-1較對(duì)照組低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織bFGF表達(dá)(×400)

2.4 大鼠HbA1c的變化 與正常組比較，模型組大鼠HbA1c明顯增高〔(18.15±1.86)%vs(6.48±1.28)%，P＜0.01〕，與模型組比較，治療組及對(duì)照組HbA1c均較模型組明顯降低〔(12.88±2.77)%，(15.01±1.64)%，P ＜0.01〕，治療組HbA1c較對(duì)照組低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠ET-1、IL-1、bFGF含量( s，n=8)

表1 各組大鼠ET-1、IL-1、bFGF含量( s，n=8)

與模型組相比:1)P＜0.01;與對(duì)照組相比:2)P＜0.01，3)P＜0.05

正常組 － 10.50±1.661)2)16.74±3.271)2)0.536±0.1271)2)模型組 － 19.81±1.89 50.97±7.45 0.202±0.042治療組 14.5 g/kg 13.80±1.1813)28.34±4.4813)0.421±0.0541)3)對(duì)照組 75 mg/kg 16.02±0.911)38.13±7.571 0.290±0.038

3 討論

DF是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是糖尿病患者致死、致殘的重要原因之一，不僅嚴(yán)重影響著糖尿病病人的壽命和生質(zhì)量，也給家庭、社會(huì)和國(guó)家?guī)?lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)，在DF潰瘍中，生長(zhǎng)因子和其他傷口愈合所需要的介質(zhì)發(fā)生異常〔2，3〕，從而影響了傷口愈合。因此深入研究這些因子在DF潰瘍中的變化及作用，有助于揭示潰瘍難以愈合的機(jī)制，并為臨床治療提供新的思路。

IL-1是典型的致炎細(xì)胞因子，幾乎各種有核細(xì)胞均能產(chǎn)生，但不同的情況，不同的細(xì)胞，不同的濃度，IL-1的作用可能不同，甚至完全相反。在創(chuàng)傷后的急性炎癥期，IL-1發(fā)揮著重要的作用，在傷后的第3～5天IL-1處于低水平，第8天達(dá)到高峰，肖正華等〔4〕的研究表明糖尿病足難治潰瘍面上IL-1顯著增高，進(jìn)而抑制了成纖維細(xì)胞的增殖，從而使?jié)冸y以愈合。而降低潰瘍面上IL-1含量，可加速創(chuàng)面愈合。

ET-1是一種21個(gè)氨基酸組成的多肽，是目前所知道的作用最強(qiáng)的血管收縮劑，其在糖尿病下肢壞疽的發(fā)生及預(yù)后中起著重要的作用。研究表明，血管內(nèi)皮功能的改變是糖尿病血管并發(fā)癥的始發(fā)因素，高血糖狀態(tài)會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞引起大量的ET釋放〔5〕，從而使局部血管處于持續(xù)收縮狀態(tài)，刺激血管平滑肌細(xì)胞增生，血小板凝聚，單核細(xì)胞變成泡沫細(xì)胞，形成粥樣斑塊，繼發(fā)血栓，出現(xiàn)相應(yīng)的肢體缺血表現(xiàn)。降低血漿中ET-1含量可加速創(chuàng)面愈合〔6〕，而對(duì)糖尿病足潰瘍面組織中ET-1含量的情況尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示大鼠糖尿病潰瘍面中ET-1含量明顯高于非糖尿病組，其潰瘍面愈合亦較慢，而經(jīng)治療后ET-1含量下降，其潰瘍面愈合較快，提示潰瘍面高濃度ET-1阻礙肉芽生長(zhǎng)、潰瘍面愈合。

bFGF是一種多功能細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有很廣泛的生物活性，能刺激來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的生長(zhǎng)，如成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，在創(chuàng)面形成后的正常修復(fù)中起著重要的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，由于潰瘍創(chuàng)面的糖含量升高，使得晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)大量蓄積，一方面高糖狀態(tài)可使FGF發(fā)生糖基化從而喪失其活性，另一方面糖基化的生長(zhǎng)因子可以與修復(fù)細(xì)胞表面糖基化產(chǎn)物受體RAGE結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病局部創(chuàng)面遲發(fā)但持續(xù)的慢性炎癥，并改變修復(fù)細(xì)胞的合成分泌功能及增殖活性，導(dǎo)致潰瘍面難以愈合〔7，8〕。

DF潰瘍屬中醫(yī)“潰瘍”、“脫疽”、“消渴”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)病機(jī)制主要是消渴日久，氣陰兩虛，經(jīng)脈瘀阻，血行不暢，肢端失養(yǎng)，加之濕熱下注，久之則肢端壞死。故治療上應(yīng)采用益氣養(yǎng)陰，活血通絡(luò)清熱利濕的治療方法，清利活血湯中黃芪、山藥、生地益氣養(yǎng)陰，當(dāng)歸桃仁、紅花川芎養(yǎng)血活血，玄參、蒼術(shù)、銀花、黃連、土元、魚腥草清熱利濕，土鱉蟲咸寒歸肝經(jīng)，有破瘀血、續(xù)筋骨功效，現(xiàn)代研究表明土鱉蟲具有較好的降血糖、血脂作用〔9〕;三黃生肌紗條在我科臨床應(yīng)用多年，具有良好的清熱活血生肌斂瘡的作用，實(shí)驗(yàn)研究其可以提高局部創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用〔10〕。內(nèi)外相和，清利活血生肌斂瘡，可較好地加速DF潰瘍面的愈合。

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