P物質對急性心肌缺血大鼠心功能的影響

王利利，張瑞林，郭 政

(山西醫科大學第二臨床醫學院麻醉科，太原 030001;*通訊作者，E-mial:guozheng713@yahoo.com)

急性心肌缺血可導致心肌細胞損傷，主要原因是心肌氧供和氧需失衡。心肌缺血后兒茶酚胺分泌增加是神經系統的適應性調節反應，但交感神經過度激活可導致心肌氧耗增加，更加造成心肌氧供和氧需失衡，加重心肌細胞損傷甚至對心功能造成影響。因此，缺血性心肌病治療的一個關鍵問題應該是降低心臟氧耗，盡量保持心肌氧供和氧需平衡。維持心肌代謝穩定的前提下，維持心臟血流動力學平穩。

研究顯示，結扎動物冠狀動脈(coronaryartery occlusion，CAO)早期 P 物質(substance P，SP)及其mRNA在缺血心肌組織中表達上調［1］，同時在支配心臟感覺神經背根神經節中的含量較手術對照組有明顯升高［2］，提示SP介導急性心肌缺血后傷害性信號在脊髓的傳導，并且參與急性心肌缺血時心臟活動的調節［3］。SP對離體灌流維持自然搏動心臟的作用文獻報道以負性變時和變力為主［4－6］，也有作用相反的報道［7］。但有關SP對心臟急性心肌缺血后左心室功能的影響文獻未見報道，本實驗對此進行研究。

1 資料和方法

1.1 主要試劑和器材

SP(批號:016K51041，Sigma公司，美國)，NK-1受體阻斷劑(D-SP)(批號:016K16041，Sigma公司，美國)，K-H 液(mmol/L:NaCl 118.5、KCl 4.8、CaCl21.7、KH2PO41.2、MgS041.2、NaHCO325.0、葡萄糖12.0，pH 值 7.4，天津化學試劑三廠)，使用時充純氧進行氧合。Langendorff離體心臟灌流裝置(四川成都儀器廠)，RM6240B/CSHENG生物信號采集處理系統和壓力換能器(四川成都儀器廠)，WZS-50F型微量泵(B.Braun公司，德國)。

1.2 實驗方法

健康成年雄性SD大鼠，體重250－300 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2.1 在體實驗 大鼠用25%烏拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射麻醉滿意后，連接心電圖(Ⅱ導聯)，尾靜脈置入24G套管留置針以方便給藥。將大鼠仰臥位固定于操作臺上，消毒后氣管切開置管，接動物呼吸機控制呼吸，呼吸頻率70次/min，潮氣量8 ml/kg。分離右頸總動脈并逆行插入PEBAX硬膜外麻醉導管，導管內預充有含肝素(0.05%)的生理鹽水，并與壓力換能器連接，觀察血壓壓力波變化，繼續小心送導管到左心室內，直到出現穩定的心室壓力波。監測左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室最大收縮速率(LV+d P/d tmax)、左心室最大舒張速率(LV－d P/d tmax)和HR，計算左心室發展壓(LVDP=LVSP－LVEDP)。動物穩定15 min后，按照不同分組分別經尾靜脈給予生理鹽水或D-SP(10－7mol/L)，注射容積為1 ml/kg，后用50μl生理鹽水沖管，操作時間約10 s。尾靜脈給藥后，于左第Ⅳ肋間開胸暴露心臟，切開心包，待給藥后15 min，用6－0無損傷縫線在左心耳右緣與肺動脈圓錐左緣之間冠狀動脈左前降支起點下2 mm環繞冠脈穿線結扎，手術對照組暴露冠狀動脈左前降支后不結扎。胸腔負壓引流后，逐層關胸，大鼠自主呼吸恢復，所有手術切口均用1%利多卡因做局部皮下浸潤。記錄從給藥前5 min到冠狀動脈結扎后60 min的心功能參數及心率。

1.2.2 離體實驗 大鼠用25%烏拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射麻醉滿意后，快速開胸取出心臟，置于0－4℃K-H液中使之停搏，去除心包膜，修剪分離升主動脈，行主動脈插管(插管不宜過深，以免堵住冠脈開口，同時要避免主動脈內殘留氣體，以免形成氣栓)，用Langendorff裝置K-H液(37℃恒溫)進行逆向灌流，使心臟復跳，調整冠脈灌注流量約10 ml/min。用眼科剪在左心耳根部剪一小口，向左心室逆行置入一帶小球囊的細管，將細管連接于壓力換能器上，調整球囊充液量，使LVEDP為5－8 mmHg(1 kPa=7.5 mmgHg)。同時將三個電極分別置于心尖、右心室游離壁，主動脈根部，監測指標同在體研究，待心臟復跳穩定后，進行后續實驗。心臟恢復穩定搏動的標志為:LVDP＞65 mmHg，HR＞250次/min。在心臟恢復穩定搏動10 min后開始給藥，給藥方式為用微量泵以0.5 ml/min的速度從主動脈套管的側支給藥。按照不同分組分別給予生理鹽水或SP(10－6mol/L)，給藥時間約15 min。給藥后用同在體模型類似的方法結扎冠脈，手術對照組除不結扎冠脈外，其余操作同CAO組。

1.2.3 TTC染色 為確認冠狀動脈結扎模型成功，實驗結束時尾靜脈注射1%的伊文氏藍1.5－2 ml，快速取出心臟。剔除左心室以外部分后將左心室置于－70℃保存。染色時取出心臟，將左心室按垂直于心臟縱軸方向自心底向心尖平均切成5片，置于37℃ 1%氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)中避光孵育15 min后，用4%多聚甲醛固定48 h，非缺血區心肌為藍色，缺血區心肌為紅色(黑白圖片非缺血區心肌為黑色，缺血區心肌為蒼白色)。

1.3 實驗分組

在體和離體實驗各分三組，每組8例:手術對照組(sham組，生理鹽水干預，不結扎冠脈);急性結扎冠脈組(CAO組，冠脈結扎前生理鹽水干預);D-SP(在體)或SP(離體)干預組(D-SP組或SP組，冠脈結扎前D-SP或SP干預)。

1.4 指標測定

記錄從給藥前5 min到冠狀動脈結扎后60 min的左心室功能參數和心電圖，以5 min為單位計算各項心功能參數的平均值。

1.5 統計學分析

統計學處理采用SPSS13.0統計軟件包進行分析，所有資料以±s表示，組間比較采用重復測量的單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性心肌缺血模型

CAO后心電圖顯示ST段抬高，QRS波群增高變寬，并可見不同類型的室性心律失常(圖1)。TTC染色(圖2，見第503頁)明確顯示缺血心肌組織，提示動物模型成功。

圖1 離體灌流大鼠心臟CAO前后心電圖變化Fig 1 Changes of electrocardiogram before and after the CAO of rat heart in vitro

2.2 D-SP對在體大鼠CAO后左心室功能的影響

在體心臟實驗顯示，與sham組相比，CAO組的各項心功能參數變化沒有統計學意義(P＞0.05);與CAO組相比，D-SP組CAO后LV+d P/d tmax顯著升高(P＜0.01)，LV－d P/d tmax降低(P＜0.05)，對LVDP的影響主要發生在 CAO后10－35 min，對LVEDP的影響主要發生在CAO后20－60 min，DSP對LVDP和LVEDP的影響雖然未達到統計學差異(P＞0.05)，但是顯示明顯的趨勢(見圖3)。

2.3 SP對離體大鼠心臟CAO后左心室功能的影響

與sham組相比，CAO組的LVDP和LV+d P/d tmax降低，LV－d P/d tmax升高，其中對LV+d P/d tmax和LV－d P/d tmax的影響主要發生在CAO后10－30 min(P＜0.05)。與CAO組相比，SP組預先干預使離體大鼠心臟CAO后LVDP和LV+d P/d tmax降低，其影響主要發生在CAO后的30－60 min，差異有統計學意義(P＜0.05)，使CAO后的LVEDP顯著升高(P＜0.01)，對LV-d P/d tmax的影響主要發生在CAO后的35－60 min，差異有統計學意義(P＜0.05，見圖4)。

2.4 SP、D-SP干預對CAO前心功能參數及 CAO后心率的影響

SP或D-SP對離體或在體CAO前各項心功能參數的影響無統計學意義(P＞0.05，見圖3，4)。SP或D-SP對離體或在體大鼠心臟CAO后心率的影響無統計學意義(P＞0.05，見圖5)。

圖2 急性結扎冠狀動脈后左心室TTC染色結果Fig 2 TTCstaining results of the left ventricle after acute coronary artery ligation

圖3 D-SP對在體大鼠心臟CAO后左心室功能的影響Fig 3 Effects of D-SP on the cardiac functions during CAO in vivo

圖4 SP對離體灌流大鼠心臟CAO后左心室功能的影響Fig 4 Effects of SP on the cardiac functions during CAO in vitro

圖5 SP和D-SP對大鼠心臟CAO后HR的影響Fig 5 Effects of SP and D-SP on heart rate during CAO in rats in vivo and in vitro

3 討論

急性心肌缺血可引起包括缺血心肌本身在內的機體一系列復雜的應激變化，支配心臟的神經系統的激活發揮調節作用，以維持心臟功能的穩定。感覺神經遞質SP作為一種神經多肽可參與心肌缺血傷害性信號的傳遞［2］，CAO后胸3－4脊髓段Ⅰ－Ⅶ板層SP釋放增加，胸段背根神經切斷后CAO引發的SP的釋放減弱［8］。在大鼠心肌缺血過程中，胸段脊髓至少部分通過辣椒素受體機制釋放SP［9］。

本實驗小組前期研究發現，CAO后1，3，6 h時，心肌組織和胸段背根神經節中SP和其mRNA的表達均上調［1，2］。在某些特定的病理及生理條件下，比如糖尿病和老年患者，感覺神經功能受損［10］，SP的心臟保護作用隨之也受到影響［11］。糖尿病患者由于心臟中降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)和SP的含量下降以及辣椒素受體表達下調，失去了缺血后處理的心臟保護作用［12］。由于內源性的CGRP和SP釋放減少，與正常大鼠相比，辣椒素去神經大鼠急性心肌缺血后心肌損傷加重［13］。

綜合以上證據說明，SP在傳遞心臟傷害性刺激的同時可能與其他心臟支配神經共同參與心臟功能的調節。本實驗中觀察到在體和離體心臟對CAO的差異性反應顯示了急性心肌缺血時傳出神經對心臟的調節作用。

急性心肌缺血后，臨床上治療的關鍵是降低心臟氧耗的前提下維持穩定的血流動力學。研究發現，SP對離體灌流維持自然搏動心臟的作用是降低心率、減弱心肌收縮力(負性變時變力)［5－7］，即 SP可以降低離體灌流維持自然搏動心臟的氧耗。也有實驗觀察到，SP對離體心臟的心率并沒有直接影響［14］，相反的研究結果顯示，SP對心臟具有正性變時變力作用［8］，因此有關SP對離體灌流維持自然搏動心臟心功能的影響文獻報道不盡一致。SP對急性心肌缺血后心功能的影響以往文獻未見報道。

SP的生物學功能由其特異性受體即神經激肽受體介導。該受體共有三種亞型，NK-1、NK-2和NK-3，心臟中三種受體亞型都存在，SP主要作用于NK-1受體，D-SP是 NK-1受體特異阻斷劑［15］。本實驗觀察到，采用特異性受體阻斷劑D-SP預先阻斷內源性SP的作用，大鼠CAO后心臟的LV+d P/d tmax顯著升高，LV-d P/d tmax顯著降低，即左心室的收縮和舒張(速率)功能明顯加強，提示內源性SP在急性心肌缺血早期對心功能的影響是負性肌力的。在離體研究中觀察到，SP預先干預使CAO后的LVDP和+d P/d tmax降低，LVEDP顯著升高，即減弱CAO后左室心功能，進一步驗證了在體研究結果，與大部分文獻報道的SP對離體非缺血心臟的負性變力作用一致［5－7］。提示內源性 SP通過 NK-1受體介導減弱CAO后的左心室功能，降低心臟氧耗，這對CAO后缺血和非缺血心肌的保護十分重要。

SP對心臟功能調節的生物學機制尚不清楚。研究發現SP對離體心臟的減慢心率作用可被阿托品阻斷，相反可被膽堿酯酶抑制劑加強［7］。當內源性乙酰膽堿被耗竭時，SP的心率減緩作用可被減弱［16］。推斷SP可能通過刺激心內膽堿能神經間接地影響心臟功能，產生負性變力作用。有關SP的作用機制包括與心臟交感神經和副交感神經的關系有待進一步研究闡明。

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