雙孢蘑菇雜交新菌株W192選育研究*

廖劍華

(福建省農業科學院食用菌研究所，福建 福州 350014)

雙孢蘑菇營養豐富，味道鮮美，是目前世界上人工栽培最廣泛、產量最高、消費量最大的食用菌，產量約占世界食用菌總產量的40%左右，雙孢蘑菇也是我國目前最大宗的出口創匯食用菌。

應用雙孢蘑菇同核不育株間雜交技術進行品種的改良，獲得的雜交菌株已占蘑菇生產用種的100%。目前同核不育單孢雜交已成為世界上應用最廣泛的方法，它通過單孢分離獲得自體不育的同核單孢子，這種單孢子是自體不育的，只有通過雜交成為異核體，才能出菇結實。福建省農業科學院食用菌研究所利用同核不育單孢配對雜交，育出高產優質抗逆的雙孢蘑菇雜交新菌株As2796、As4607等，占全省蘑菇用種量的95%，全國的80%，累計推廣應用8×108m2以上，增產鮮菇300萬t，新增菇農收入100多億元[1]。

雙孢蘑菇雜交品種As2796自1992年選育成功至今已使用20年，在近年的栽培過程中表現出一些氣生菌株的特性，如在濕度較大、通氣不良的菇房中容易形成菌被，出菇過程中水分與通氣管理不當容易產生叢菇，這些現象直接導致雙孢蘑菇的減產，為了減少在栽培中出現的這些不利特性，試圖與貼生親本菌株02進行回交，改良As2796菌株的栽培特性，進一步提高產量。經過多次的回交試驗，篩選獲得雜交新菌株W192，該菌株進一步結合了高產菌株的生長特性，表現為菌絲生長快、不易長菌被、產量高等優良性狀，已通過福建省的新品種認定，2012年～2013年產季推廣面積占福建省10%以上。

1 材料與方法

1.1 材料

供試雙孢蘑菇的異核體菌株02(H2型高產品種，引自荷蘭)、As2796(福建蘑菇菌種研究推廣站雜交菌株)，它們的同核體菌株208(HG4s)、286(Hs1)等菌株由福建省農業科學院食用菌研究所提供。

1.2 方法

1.2.2 配對雜交技術

不育同核體的分離培養、鑒定與配對雜交技術，雜交菌株的分離、鑒定步驟均同前法[2－4]。

1.2.3 生物學特性測定

(1)溫度試驗 (栽培種培養基法測定)

同一菌株接種于含水60%的發酵棉籽殼培養基中 (以發酵棉籽殼為主要基質，添加牛糞粉、麥麩等輔助材料)，分別在 10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下培養，每種3次重復，觀察菌株在低溫與高溫下的走菌速率。

(2)培養基含水量試驗

同一菌株分別接種于含水50%、55%、60%、65%和70%的發酵棉籽殼培養基中 (以發酵棉籽殼為主要基質，添加牛糞粉、麥麩等輔助材料)，在24℃下培養，每種3次重復，觀察菌株在不同含水量培養基中的走菌速率。

(3)pH值試驗

PDA培養基分裝于500 mL的三角瓶中，高壓滅菌后，取幾個培養基未凝固的三角瓶，用1 mol·L－1HCl或 1 mol·L－1NaOH進行pH值調節，準確記錄調到各種pH值所需的HCl或NaOH的量，然后在超凈工作臺內對各個三角瓶培養基進行pH值調節，隨后立即倒入90 mm的培養皿制備成平板培養基。pH值檢測范圍4、5、6、7、8、9、10，每個pH值3次重復，觀察菌株在不同pH值下的走菌速率。

1.2.4 酯酶同工酶測定

酯酶同工酶電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠制備、電泳及結果分析方法均同前[5，6]。

1.2.5 栽培篩選

(1)初篩

所獲的雜交菌株以塑料淺箱進行栽培，每個淺箱投二次發酵好的糞草培養料15 kg，面積為0.15 m2，每個菌株均3次重復，在床架上按隨機區組排列。

(2)復篩

以床架式栽培進行出菇試驗，每區面積1 m2，投二次發酵好的糞草培養料60 kg，每菌株4次重復。

(3)中型生產試驗

于2010年～2011年產季在長樂市鶴上鎮希爾帆食用菌有限公司進行中型生產試驗，菇房為永久性紅磚房，采用2次發酵層架式栽培，中試栽培面積為每個菌株300 m2，設置在同一座菇房，3次重復，每個菌株的培養料投料量與配方相同，堆料、后發酵、播種、復土時間同步，水份及通風管理按常規進行。

在初篩、復篩及中試生產試驗過程中，分別觀察不同菌株的菌絲生長速率、栽培特性和產質量性狀。

2 結果與分析

2.1 選育過程

以酯酶同工酶為遺傳標記，從供試異核體親本As2796和02分離出的同核不育菌株，通過配對雜交，獲得雜交種。其中W192菌株是由02分離的同核不育株02－286和As2796分離的同核不育株2796－208配對雜交獲得雜交種 (圖1)。

2.2 生物學特性

2.2.1 溫度適應性

菌株W192菌絲生長溫度試驗結果表1。

表1 W192菌絲生長溫度試驗結果

溫度試驗結果表明，雜交新菌株W192的菌絲生長溫度范圍為10℃～35℃，適宜生長溫度為25℃，致死溫度為35℃。

3.2.2 培養基含水量適應性

菌株W192菌絲生長濕度試驗結果見表2。

表2 W192菌絲生長濕度試驗結果

培養基不同含水量試驗結果表明，雜交新菌株192的菌絲生長的適合范圍為50%～70%，適宜生長的范圍為50%～65%。

3.2.3 pH值適應性

菌株W192菌絲生長平板pH值試驗結果見表3。

表3 W192菌絲生長平板pH值試驗結果

平板pH值試驗結果表明，雜交新菌株W192的菌絲在PDA平板上生長的pH范圍為5～9，適宜生長平板pH為7。

2.3 同工酶分析

菌株同工酶分析結果見圖2。

雜交新菌株W192的酯酶同工酶表型為HG5型，呈典型的雜合態，但與親本As2796雜合態表型存在明顯的差別，其中標記帶A、B是W192特有的酶帶。

2.4 栽培特性

2.4.1 初篩

雜交菌株與對照品種產量、質量對比情況見表4。

表4 雜交菌株與對照品種產量、質量對比

雜交菌株出菇品比試驗結果表明，有5株比對照As2796長滿培養料時間快1 d～2 d，采菇時間提早1 d～2 d，產量與高產親本品種02接近，其中W192產量比對照As2796提高23.5%，粒重與對照的優質親本As2796相當，統計分析顯示雜交新菌株菌株產量與對照菌株As2796相比差異達到極顯著水平。

2.4.2 復篩

部分雜交菌株與對照品種產量、質量對比情況見表5。

表5 部分雜交菌株與對照品種產量、質量對比

上述優選出的5株雜交新菌株經過復篩，品比試驗的結果表明，雜交新菌株與對照As2796產量相比均有較大提高，而粒重與對照的優質親本As2796相當，其中W192產量提高20%，統計分析顯示雜交新菌株產量與對照菌株As2796相比差異達到極顯著水平。

2.4.3 中試生產試驗

不同菌株生長發育情況見表6。

表6 不同菌株生長發育情況

雙孢蘑菇新品種W192菌絲生長為貼生類型菌絲，W2000菌絲生長為半貼生類型，As2796是氣生型菌絲。由表6可見，在栽培種麥粒培養基上，3個品種均為30 d左右透瓶。在床面培養料吃料走菌時間快1 d～2 d，新菌株W192、W2000爬土能力強，出菇時間比As2796快2 d～3 d，出菇潮次比較明顯。各菌株產量比較情況見表7。

表7 各菌株產量比較

由表7可見，從2010年12月12日開始采收雙孢蘑菇到2011年4月12日結束。各菌株產量分別為W192雙孢蘑菇總產量 3 168.5 kg、平均單產 10.56 kg·m－2，W2000總產量3 048.3 kg、平均單產10.16 kg·m－2，As2796總產量2 634.7 kg，平均單產8.78 kg·m－2;W192、W2000兩菌株分別比對照菌株As2796增產20.2%和15.7%，質量與As2796相當(圖3～圖6)。

3 討論

雙孢蘑菇的新品種選育主要采取雜交育種技術，應用雜交菌株與其親本進行回交，可進一步提高雜交菌株的產量。本文通過雜交菌株As2796與其高產親本02的不同配對雜交組合篩選試驗，獲得一系列高產優質菌株，雜交菌株在產量上比As2796均有大幅度的提高。

雜交新菌株W192菌絲形態表現為貼生類型，通過PDA培養基的多次轉管，菌絲形態表現穩定，在麥粒培養基上也不會出現菌被，適合于塑料無菌透氣袋菌種的生產。

雜交新菌株W192適用于經二次發酵的糞草料栽培，表現出耐肥、耐水和適應性廣的特點，要求每平方米投料量30 kg～35 kg，C∶N≈(28～30)∶1，含氮量 1.5%～1.6%，含水量65%～68%，pH值在7左右，正常管理的噴水量不少于高產菌株。菌種播種后萌稍慢，菌絲吃料速度中等偏快，生長強壯有力，抗逆性較強，不易出現菌被。菌絲爬土速度中等偏快，紐結能力強，生長快，因此開采時間比As2796早1 d～2 d。該菌株基本單生，成菇率高，1潮～4潮產量較多，轉潮比較明顯，該菌株不宜薄料栽培，料含氮量太低或水分不足都會影響產量或產生薄菇和空腹菇等質量不良現象。

[1]王澤生.雙孢蘑菇雜交育種研究進展[J].中國食用菌，1992，11(4):10－12.

[2]Wang HC，Wang ZS.The prediction of strain characteristics of Agaricus bisporus by the application of isozyme electrophoresis [J].Mushroom Science，1989，12(1):87－100.

[3]Wang ZS，Liao JH.Study on the crossbreeding techniques of Agaricus bisporus [J].Microl.Neotrop.，1990(3):1－12.

[4]Wang ZS，Wang HC.Isozyme patterns and charateristics of hybrid strains of Agaricus bisporus [J].Microl.Neotrop.，1990(3):19－29.

[5]Wang ZS，Liao JH，Li FG，et al.Studies on the genetic basis of esterase isozyme loci Est A，B and C in Agaricus bisporus[J].Mushroom Science，1991，13(1):3－9.

[6]王澤生.應用同工酶電泳法分析雙孢蘑菇白色菌株間的種內親緣關系 [J].福建食用菌，1991，1(2):20－25.