p38MAPK在Aβ25-35誘導AD大鼠不同腦區的表達＊

西安交通大學第二附屬醫院神經內科（西安710004）

張桂蓮 杜 赟 姚 麗 張 茹 劉璟潔 卜 寧 吳海琴 張 磊 郭英英 李婷婷

已有報道，阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）與嗅覺損害有關，嗅覺閾值與AD的程度有關［1，2］。單純毀損嗅球可降低大鼠學習記憶功能［3］。嗅覺損害可能在主要臨床癥狀出現前出現［4］。在AD的早期階段，嗅球即被涉及，大量的淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）斑和tau蛋白纖維纏結貫穿了嗅覺神經系統，這是對嗅覺早期損害的有力支持［2，5］。然而，也有研究認為，雖然在嗅覺中樞出現AD的特征性病理改變，而嗅覺的損害并沒有優先［6］。我們早期的研究分別觀察了側腦室注射Aβ25-35后MAPK信號轉導通路家族的成員之一—磷酸化p38MAPK（p-p38）在海馬CA1區及嗅球的各自表達，為了進一步探討是否嗅球的損害先于海馬，我們擬對比觀察p-p38在大鼠嗅球與海馬CA1的表達，進一步探討不同腦區p38與AD臨床結果的關系。

材料和方法

1 材 料

1.1 實驗動物的篩選及分組：選擇健康成年雄性SD大鼠，體質量260±20g，根據實驗要求標準環境下喂養1周，每籠3～5只。大鼠在Y型迷宮內適應3min后，給予適當電擊，直至3臂均探索進入為止，選擇活躍、對電擊反應敏感、逃避反應迅速的72只大鼠供實驗用。將其隨機分為陰性對照組、癡呆組、抑制劑組和溶媒對照組，每組18只。再根據觀察時間點將每組大鼠分為4d、7d和14d三組，每組6只。

1.2 實驗試劑及其配制：β-淀粉樣蛋白多肽片段（Aβ25-35）、p-p38抗體（Thr180／Tyr182）、p38抑制劑—SB203580、二甲基亞砜（DMSO）分別由美國Sigma，Alexis Cell及Signaling公司提供。

SB203580溶液及Aβ25-35聚合態的制備：將Aβ25-35用無菌生理鹽水稀釋，配制成濃度為3nmol／μl的溶液，使用前將Aβ25-35溶液在37℃孵育4d即可成為聚合態的 Aβ25-35。用1%DMSO配制成濃度為0.1nmol／μl的SB203580溶液，-20℃保存備用。

2 方 法

2.1 動物模型的構建：術前12h給大鼠禁食，4h禁水。用1%戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔注射麻醉，等大鼠的翻正反射消失后，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上。選擇右側側腦室為注射靶區，于前囟向后0.8mm，中線旁開1.5mm處，用牙科鉆鉆開顱骨，挑破硬腦膜。①癡呆組：用微量注射器垂直進針3.8mm，以1μL／min的速度緩慢注入 Aβ25-35溶液5μl，留針5min后緩慢拔針，縫合切口。②陰性對照組：用同樣方法將等量生理鹽水注入大鼠右側側腦室。③抑制劑組：同法將SB203580溶液5μl注入大鼠右側側腦室。30min后，將Aβ25-35溶液5μl注入。④溶媒對照組：用同樣方法將1%DMSO5μl注入大鼠右側側腦室，30min后，再將Aβ25-35溶液5μl注入。術后動物單籠飼養至清醒，并每日肌注青霉素鈉5萬單位，共3d以防感染。

2.2 動物行為學測試：四組大鼠于以上處理后4d、7d、14d行Y迷宮測試。記錄實驗中每只大鼠達到學會標準的訓練次數（Number，N），完成所有反應中錯誤反應的次數（Error number，EN），全天總反應時間（Total reaction time，TRT）。

2.3 免疫組化檢測：四組大鼠在行為學測試后快速灌注取腦，分離嗅球及海馬，分別常規進行石蠟包埋切片，層厚5μm。采用免疫組化SABC法檢測p-p38蛋白表達量，p-p38抗體的濃度為1∶50。

2.4 圖像采集及分析：選取每只大鼠的海馬及嗅球切片各1張，用圖像分析儀檢測每張切片海馬CA1區及內嗅小球層p-p38表達陽性細胞的灰度，每張切片隨機檢測5次，取其平均值（灰度值范圍為0～255，分別由黑色～白色表示）；灰度值越低，表示表達的陽性細胞數越多。

2.5 統計學方法：所有數據采用SPSS13.0軟件建庫、處理。各指標用±s表示。兩組以上計量數據比較采用單因素方差分析，即F檢驗，其中兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05認為有統計學差異。

結 果

1 行為學檢測 由表1可見，在AD大鼠建模4d時，各組大鼠的行為學指標基本正常；陰性對照組各時間點間比較，大鼠達到學習標準的N、EN和TRT無明顯統計學差異（P＞0.05）。癡呆組在Aβ注射7d、14d后，N、EN和 TRT均明顯增加（P＜0.05）。抑制劑組與癡呆組比較，N、EN和TRT有改善（P＜0.05）。抑制劑組與溶媒對照組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。提示癡呆組大鼠在Aβ注射7d后，學習記憶能力顯著下降；而應用抑制劑SB203580后，大鼠學習記憶能力得到改善。

表1 每組動物的行為學結果（n=6，±s）

表1 每組動物的行為學結果（n=6，±s）

注：與陰性對照組比較，＊P＜0.05；與溶媒對照組比較，＃P＜0.05；與抑制劑組比較，△P＜0.05

學會標準的訓練次數 完成所有反應中錯誤反應的次數 全天總反應時間組 別4d 7d 14d陰性對照組 19.67±3.88 19.50±3.62 23.17±3.19 3.38±1.76 3.55±1.78 3.64±1.95 4d 7d 14d 4d 7d 14d 506.03±41.66 524.06±46.01 533.95±26.50癡呆組 22.50±2.95 41.50±4.95＊△51.33±6.80＊△ 3.61±1.86 5.26±0.81＊△ 6.95±1.19＊△ 520.18±35.41 933.39±35.76＊△1320.62±84.42＊△溶媒對照組 22.83±4.02 42.83±4.17 51.67±4.23 3.63±1.63 5.11±1.52 6.88±2.14 526.53±56.80 963.19±41.89 1282.60±89.66抑制劑組 23.67±3.56 30.00±5.76＃ 34.50±3.94＃ 3.54±1.57 4.06±1.25＃ 4.10±1.68＃ 537.15±56.74 660.08±41.12＃ 856.02±43.31＃

2 p-p38蛋白在大鼠海馬CA1區及嗅球的表達經過免疫組化染色，光鏡下的p-p38蛋白免疫反應產物呈棕黃色，主要表達于細胞核內。由表2及圖1A-F可見，在海馬CA1區，陰性對照組各時間點可見少量p-p38蛋白表達；癡呆組在Aβ注射4d出現明顯的pp38蛋白表達，隨著觀察時間的延長，p-p38蛋白表達逐漸增多；且各時間點均顯著高于陰性對照組（P＜0.01）；而抑制劑組各觀察時間點，p-p38蛋白的表達介于陰性對照組和癡呆組之間，同時與溶媒對照組也明顯不同，在應用SB2035804d時，p-p38蛋白幾乎被完全抑制，而在7d，14d被部分抑制。

另外，由表2及圖2A-F可見，每組各時間點pp38蛋白在嗅球的表達均低于海馬的表達（P＜0.01），但p-p38蛋白在嗅球的表達規律與在海馬CA1區的表達規律相一致。

表2 每組大鼠海馬與嗅球p-p38蛋白的灰度（n=6，±s）

表2 每組大鼠海馬與嗅球p-p38蛋白的灰度（n=6，±s）

注：與陰性對照組比較，＊P＜0.01；與抑制劑組比較，△P＜0.01；與癡呆組7d和14d比較，▲P＜0.01；與癡呆組14d比較，★P＜0.01；與溶媒對照組比較，＃P＜0.01；與CA1區比較，※P＜0.01

組 別嗅球陰性對照組 182.24±1.49 197.08±2.19※ 180.08±1.80 194.58±1.42※ 180.69±2.05 194.22±2.38 4d CA1區 嗅球7d CA1區 嗅球14d CA1區※癡呆組 177.36±1.12＊△▲186.60±3.79＊△▲※ 168.57±2.23＊△★ 180.85±5.11＊△★※ 161.93±0.77＊△ 174.70±3.49＊△※溶媒對照組 176.98±1.48 185.91±0.58※ 167.09±2.05 183.32±1.39※ 159.55±1.48 182.52±3.20※抑制劑組 181.37±0.98＃ 194.75±2.08＃△☆※ 175.67±2.26＃ 191.55±1.62＃△※ 170.38±1.34＃ 186.65±3.47＃△※

圖1 p-p38蛋白在Aβ誘導大鼠損傷海馬CA1的表達

圖2 p-p38在Aβ誘導大鼠損傷嗅球的表達

討 論

研究報道，p38在細胞應激時的炎癥反應，參與了風濕性關節炎等外周疾病的病理過程。近年來發現，除了外周的作用，p38可能作為激酶級聯中的終末激酶、參與轉錄調控、參與炎癥反應、促使tau蛋白過磷酸化、促使神經元凋亡或與其他信號轉導通路協同介導細胞應激誘發的基因表達和酶活力改變等途徑，在AD病理機制中發揮作用［7，8］，研究顯示，在 AD發生發展中，p38的作用可能類似炎癥過程的正反饋環，除了炎癥，尚有許多物質以及AD形成中的各類神經元和非神經元均可誘導其產生效應［7，9］，這種變化不僅出現于大腦皮質，也出現在海馬及嗅球，p38的激活貫穿于AD的全過程。本研究比較了注射Aβ25-35后AD大鼠嗅球與海馬p-p38蛋白的表達狀況，結果發現，建模第4天p-p38蛋白在海馬及嗅球均明顯表達，隨著觀察時點的延長，于第7天和第14天表達的p-p38蛋白逐漸增多，在各觀察時點嗅球與海馬CA1區p-p38蛋白的表達規律相一致，p-p38蛋白在海馬的表達均高于嗅球的表達，提示p38信號轉導通路確實參與了AD的病理過程，海馬CA1區對Aβ25-35誘導損傷更敏感。

在傳統的抑制劑中，SB203580具有很強的選擇性，它可以通透細胞對細胞內的p-p38活性發揮抑制作用。研究認為，SB203580并非通過阻斷上游激酶對p38的激活，而是通過競爭結合蛋白激酶ATP-結合袋，使p-p38失去了與ATP結合的能力，抑制p38催化活性而發揮作用［10］。

本實驗用0.1nmol／μl共5μl的SB203580于 Aβ注射前30min注入大鼠側腦室，觀察大鼠各項指標的變化。與癡呆組比較，抑制劑組大鼠的學習記憶障礙明顯改善，比較海馬CA1區及嗅球的p-p38陽性細胞數發現，不論在嗅球還是海馬，抑制劑組與癡呆組比較，在Aβ注射4d時活化的p-p38幾乎被完全抑制，而在Aβ注射7d，14d則被部分抑制，提示SB203580可能減輕的AD病理過程，有可能在AD治療中發揮作用，但是這種抑制作用并不持久，與相關報道一致［11］。分析p-p38僅被部分抑制的原因可能如下：由于p38在AD病程中處于一個類似炎癥過程的正反饋環內，新的應激以及Aβ持續存在，會不斷刺激更多p38分子活化，p38處于持久活化狀態，而抑制劑SB203580是通過與ATP競爭p38結合位點發揮作用，故無法阻斷上游激酶對p38的激活；并且，作為競爭性抑制劑，SB203580的應用劑量是有限的，不能抑制無限增長的p38與ATP結合活化。

由此得出，p38信號轉導通路的激活貫穿于Aβ25-35誘導的AD全過程，磷酸化的p38可表達于大鼠嗅覺中樞及海馬，雖然AD早期即有嗅覺障礙，但是海馬CA1區p-p38的表達比嗅球更明顯，說明海馬對Aβ25-35的損傷更敏感。p38抑制劑SB203580能部分減弱Aβ25-35的神經毒性作用，有望成為治療AD的新靶點。然而，由于機體的復雜性、AD發病機制的復雜性及信號轉導通路的復雜性，加之，信號通路之間的串話現象，p38在AD發病中的作用仍需要大量的研究支持。

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