近紅外光譜法測定麥芽中的β-葡聚糖

周青梅，郭立蕓，林智平

(北京燕京啤酒股份有限公司，北京，101300)

近10年來，近紅外分析技術已應用于啤酒制麥行業，對大麥粗蛋白、水分進行分析，獲得較好的研究結果。但是采用近紅外分析技術在測定麥芽β-葡聚糖含量，快速了解胚乳細胞壁溶解狀況的研究尚未見報道。麥芽中的β-葡聚糖是反應麥芽溶解狀況的重要指標，成品麥芽中β-葡聚糖含量高，說明麥芽細胞壁分解不完全，會影響淀粉和蛋白質的分解，使麥汁組成不合理，導致發酵時酵母營養不良，過濾困難，β-葡聚糖沉淀等問題［1］。另一方面，適量的β-葡聚糖存在是構成啤酒酒體和泡沫的主要成分。與傳統分析技術相比，近紅外分析具有無損檢測，分析效率高，分析速度快，分析成本低，重現性好，樣品測量一般不需預處理，光譜測量方便，適合于現場檢測(如大批量抽檢)和在線分析等獨特優勢［2］。本文研究利用近紅外光譜技術，采用對不同的數學處理方法、散射校正法和統計方法等建模條件進行分析比較分析，尋找合理的建模條件，建立麥芽β-葡聚糖的近紅外分析模型，實現快速檢測。

1 材料與方法

1.1 主要材料

所用樣品來自燕京啤酒制麥車間產的麥芽樣品，共選取160個樣品，其中100個用于定標集，60個用于預測集。選用 Baudin、Scarlett、Gairnder、Schooner、國麥內蒙古大麥、國麥甘啤4號等6個品種的麥芽。

將樣品分為2份，1份用酶法測定β-葡聚糖含量的手工值，另1份用近紅外光譜采集，建立檢測模型。

1.2 主要試劑及配制

磷酸鈉緩沖液(20 mmol/L，pH 6.5):900 mL蒸餾水溶解3.12 g NaH2PO4·2H2O，用100 mmol/L NaOH(4 g/L)調節pH到6.5，定容至1 L，4℃保存，穩定2個月。

醋酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 4.0):將2.9 mL冰醋酸加入900 mL蒸餾水，用1 mol/L NaOH調節pH到4.0，然后定容至1L，加入0.2g疊氮化鈉，4℃保存，穩定2個月。

β-葡聚糖測定試劑盒:購于Megazyme公司。

1.3 主要儀器

分光光度計，UNICO公司7200型;控溫水浴鍋(1028S型)，美國Bioetechnology公司;近紅外谷物分析儀，FOSS公司生產的1241，配套 IFT3.2、WinISIⅢ，1.50V、ODIN等化學計量軟件。

1.4 酶法測定β-葡聚糖

參照AOAC方法995.16。

1.5 近紅外定標模型的建立與檢測

1.5.1 光譜收集與光譜分析

收集有代表性的樣品，進行近紅外掃描及光譜分析，近紅外掃描采用Foss公司生產的Infratec 1241近紅外谷物分析儀進行樣品掃描，樣品要重復裝樣掃描2次［3］，保存光譜，同一樣品2次掃描使用相同的樣品名，掃描溫度控制在20～25℃，收集樣品的吸收波長為850～1048 nm。將樣品倒入進樣口，然后按分析鍵，每個定標樣品掃描2次，每次掃描設置5個子樣品，所得每一樣品吸收光譜即為10個子樣的平均吸收光譜。

1.5.2 近紅外檢測模型的建立

在進行光譜分析時，先采用數學處理和光譜預處理兩類方法來濾除噪音，以提高光譜的精細度。前者主要有導數和平滑處理兩種方法［4］，其中導數處理可提高光譜的分辨率及減小基線漂移，而平滑處理則可以去掉高頻噪音對光譜信號的干擾，本試驗選取“0.0.1”(依次為導數處理、數據間隔點、平滑處理間隔點)、“1.2.2”、“1.4.4”3 種方式。后者則采用不作散射校正、標準正常化處理、去散射處理、標準正常化+散射處理、多元散射校正、加權多元散射校正、反向多元散射校正等7種方法進行光譜散射處理。回歸方法主要采用WINISIⅢ，V1.50軟件提供的改進偏最小二乘法、偏最小二乘法和主成分分析3種回歸算法與3種數學處理和7種光譜處理方式進行組合分析，從而選取最優的方式來建立應用模型。

本研究采用全波段進行回歸分析構建回歸方程，因此，用一些重要參數來衡量回歸方程優劣，這些參數主要包括定標標準差(SEC)，定標相關系數(RSQ)，交叉驗證誤差(SECV)，交叉驗證相關系數(1-VR)。SEC是通過建立的定標模型對定標樣品集進行預測所獲得的化學分析值和近紅外分析值的標準差;SECV是定標建模過程中，進行交叉驗證時所獲得的近紅外預測值與化學分析值的標準差，通過SECV可以大致評估定標模型的預測準確度;RSQ即定標模型對定標樣品變異所描述的百分率;1-VR是定標建模過程中進行交互驗證時所得到的相關系數，即模型對樣品集濃度變化所能描述出的百分率。構建回歸方程時，相應各類標準差越小越好，決定系數越大越好。

1.5.3 近紅外模型的應用

定標模型建立后，選用一批有代表性的樣品(未用于建立定標模型)對所建立模型進行檢驗［5］，用預測集樣品進行預測，以酶法測定結果為縱坐標，近紅外預測結果為橫坐標，用一元線性回歸法評價模型的準確性和適用性。

2 結果與討論

2.1 定標樣品的代表性

利用酶法測定了收集的100個定標集樣品，其分析結果統計列于表1中所示。

從表1可以看出，用于近紅外方法建模的麥芽樣品中的β-葡聚糖含量范圍比較廣，其值已經基本覆蓋了代表麥芽中β-葡聚糖含量的高、中、低等各級水平，因此說明收集的定標集樣品具有很好的代表性。

2.2 光譜收集與光譜分析

近紅外儀掃描所得麥芽近紅外原始光譜圖見圖1，麥芽中β-葡聚糖在近紅外區吸收譜帶圖見圖2。

圖1 麥芽定標樣品的吸收光譜Fig.1 The absorlution spectrum of calibration malt samples

圖2 麥芽中β-葡聚糖在近紅外區吸收光譜帶Fig.2 The absorption spectrum of β-glucan in malt by NIR

從圖1中可見，所有光譜排列整齊有序，沒有異常的樣品光譜，且不同麥芽的吸收峰的大小不同，所以可以用近紅外光譜技術對麥芽的有關成分進行定量，且從圖2可以看出，麥芽β-葡聚糖在不同波長處吸收強度有很大差異，其中在波長886 nm、906 nm、934 nm、960 nm、1018 nm等幾處都有較明顯的吸收，可用近紅外光譜與麥芽β-葡聚糖建立對應關系后，預測麥芽的β-葡聚糖含量。

2.3 定標方式的選擇

2.3.1 不同回歸方法的定標模型結果

近紅外光譜中采用不同回歸方法對定標效果的影響見表2所示。

由表2可知，不同回歸分析方法對定標效果有一定的影響，PLS的定標效果好于MPLS和PCR。在用偏最小二乘法建立定標模型時，其難點是如何確定建立模型所使用的主成分數目。如果建立模型使用的主成分過少，就難以反映出未知樣品被測組分的光譜變化，預測精度隨之下降，出現不充分擬合(underfit)的現象;反之，如果建立模型使用的主成分過多，就會將代表噪音的主成分加入模型之中，使模型預測能力下降，導致過擬合(overfit)。目前，常用交叉驗證法來處理。本試驗利用WINISIⅢ，V1.50軟件自帶的交叉驗證(Crossing Validation)功能處理后，剔除異常樣品，確定其定標集樣本為93個，主成分數為12。

表2 近紅外光譜分析β-葡聚糖時不同回歸方法對定標效果的影響Table 2 Effections of different regression methods onβ-glucan Tcalibration by NIR analysis in malt

2.3.2 不同散射校正的定標模型結果

定標樣品經光譜散射校正后，對麥芽β-葡聚糖定標模型有一定的影響，各種散射校正對麥芽β-葡聚糖的定標模型的影響見表3。從表3中可看出不作散射處理能達到較高的RSQ和1-VR且SEC和SECV也最低，所以不作散射處理的光譜定標效果最好，說明在建立麥芽β-葡聚糖模型時。來自光散射的噪音信息較弱，無需對光譜進行散射處理。

表3 近紅外光譜分析β-葡聚糖時不同散射校正對定標效果的影響Table 3 Effections of different scatter correction on nβ-glucan Tcalibration by NIR spectrum analysis in malt

2.3.3 不同數學處理的定標模型結果

在WINISIⅢ，V1.50分析軟件中，將數學處理方法置于一個窗口中，可同時設置所需的處理方法。通過對“導數階數、導數處理的數據間隔點、平滑處理的數據間隔點”不同組合處理樣品光譜，得到β-葡聚糖的近紅外模型結果見表4。

表4 不同數學處理對麥芽β-葡聚糖定標效果的影響Table 4 Effections of different mathematical analysis on β-glucan calibration in malt

不同數學組合處理對定標的效果不是很明顯，但通過不同組合的測試結果可看出“1.4.4”(1階導數以減少光譜中噪音等因素的影響、數據間隔點取4、平滑處理間隔點取4)得到的效果更好。

2.3.4 近紅外模型的建立

結合表2、3、4通過對數學處理方法、散射校正和統計方法進行對比分析，最后選擇偏最小二乘法、不作散射校正、數學處理采用“1.4.4”等條件建立定標模型。其定標模型各參數如表5所示。

表5 麥芽β-葡聚糖的近紅外定標系數Table 5 The calibration coefficient of β-glucan in malt by NIR spectrum analysis

從表5可看出該定標模型的SEC為0.05、SECV為0.06、1-VR 為0.8275、RSQ 為0.856，有較低的各類標準差和較高的相關系數。內部驗證相關圖見圖3。樣品比較均勻地分布在中心線兩側，說明近紅外法的測定結果與實驗室酶法實際測定值趨勢一致，整體分布情況良好。

圖3 麥芽β-葡聚糖的近紅外定標內部驗證相關圖Fig.3 The cross validation correlation of β-glucan in malt by NIR spectrum analysis

2.4 近紅外測試的適用性和準確性

對預測集的60個麥芽樣品利用酶法測定其β-葡聚糖含量，并用建立的近紅外檢測模型進行預測，用一元線性回歸得到測定麥芽中β-葡聚糖含量的近紅外法預測值與酶法測定值之間的相關性，結果示于圖4。從圖4可以看出，近紅外模型對麥芽中β-葡聚糖含量的預測值與酶法測定結果的R2為0.827，可區分出麥芽中β-葡聚糖含量的高、中、低各水平，可用于生產過程中麥芽β-葡聚糖的分級控制，初步了解麥芽中β-葡聚糖含量，判斷麥芽細胞壁的分解狀況有著良好的應用前景。

圖4 酶法測定結果與近紅外測定結果的相關性Fig.4 The correlation of β-glucan between Enzymatic detection and NIR spectum analysis

3 結論

通過對數學處理方法、散射校正和統計方法進行對比分析，選擇偏最小二乘法、不作散射校正、數學處理采用“1.4.4”等條件建立了定標模型。該定標模型的 SEC 為 0.05、SECV 為 0.06、1-VR 為 0.8275、RSQ為0.856。有較低的各類標準差和較高的相關系數。說明建立的模型具有較好的穩定性和較高的準確度。

在對60個麥芽樣品分別利用酶法進行實際測定的基礎上，再利用近紅外光譜技術進行預測，結果發現酶法測定值與近紅外預測值之間的 R2達到0.827，一般情況下，近紅外法與標準方法的相關性達到0.8表明近紅外法可代替標準方法用于分級控制。說明本研究中建議的近紅外光譜法能夠對麥芽中的β-葡聚糖含量進行預測，有利于在生產過程中對麥芽β-葡聚糖的分級控制。

［1］王志堅.β-葡聚糖對啤酒釀造的影響及控制［J］.中國啤酒，2004(2):24－25.

［2］Blanco M，Villaroya I.NIR spectroscopy:A rapid-response analytical tool［J］.Trends in Anal Chem，2002，21(4):240－250.

［3］LU Wang-zhen，YUAN Hong-fu，XU Guang-tong，et al.Modern Analysis Technique of Near-infrated Spectrum［M］.Beijing:China Petrochemical Press，2000.

［4］劉輝軍，呂進，張維剛，等.茶葉中茶多酚含量的近紅外光譜檢測模型研究［J］.紅外技術，2007，29(7):429－432.

［5］周學秋.建立穩定、可靠、使用近紅外定量分析模型的方法探討［J］.第九屆全國計算機化學學術會議論文摘要集，2007.