流加不同物質對大腸桿菌DB15(pAET-8)表達人表皮生長因子的影響＊

張艷軍，李志敏，葉 勤

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004;2.華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

人表皮生長因子(hEGF)是含有53 個氨基酸的小分子多肽，具有刺激蛋白轉運、激活胞外大分子合成和促細胞增殖等作用，在臨床上具有良好的應用前景和巨大的經濟價值［1］.因此，甘人寶課題組［2］構建了pAET-8 質粒，人表皮生長因子基因在phoA 啟動子控制下表達.文獻［3］通過優化表達期pH 和葡萄糖流加策略，使得大腸桿菌DA19(pAET-8)在基本培養基中表達hEGF 水平由8 mg·L-1提高到了78.7 mg·L-1.文獻［4］在此基礎上通過優化氯化鈣的添加量和添加時間進一步提高了hEGF 在基本培養基中的表達水平，最高達到了228 mg·L-1.

phoA 表達系統不僅具有分泌表達系統的優點，而且是一種經濟的表達系統，只需限制培養基中磷的濃度即可.作為細胞生長的必需元素，限制表達階段磷元素的濃度必然會影響細胞的生理和代謝.例如，在大腸桿菌DB15(pAET-8)表達hEGF 過程中，hEGF 生產速率在表達階段初期最大，表達階段后期活菌數明顯降低［4］，以活菌數為基準的hEGF 比生產速率也有所降低，以菌體干質量為基準的hEGF 比生產速率降低更加明顯，同時還伴隨著乙酸生成速率的提高.因此，本研究考察了表達階段流加不同物質——磷酸鹽、蛋白胨(tryptone)及酵母抽提物等對大腸桿菌DB15(pAET-8)表達人表皮生長因子的影響.

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌DB15 為華東理工大學葉勤實驗室篩選得到的耐乙酸突變株［5］.質粒pAET-8 由中國科學院上海細胞與生物化學研究所甘人寶課題組［2］構建.基因工程菌DB15(pAET-8)由葉勤實驗室構建，并保存于-20 ℃的25%甘油溶液中.

1.2 培養基

所有培養基均使用去離子水配置.

1)LB 培養基 1 L 含蛋白胨(英國Oxoid 公司)10 g，酵母抽提物(Oxoid 公司)5 g，NaCl 10 g，pH 7.2.

2)M 培 養 基 1 L 含Na2HPO4·12H2O 15.12 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.011 g，葡萄糖6 g，氯化銨1 g，10 g·L-1維生素B1溶液0.2 mL，微量元素混合液［6］0.2 mL，pH 7.0.

3)MP 培養基 為磷限制的M 培養基，1 L 中含Na2HPO4·12H2O 1.89 g，KH2PO40.375 g，其他成分與M 培養基相同.

4)補料培養基 1 L 中含葡萄糖400 g，MgSO4·7H2O 10 g.

1.3 培養方法及條件

1.3.1 種子培養

將1 mL 冷凍保存的菌種DB15(pAET-8)接入裝有30 mL LB 培養基的250 mL 錐形瓶里，37 ℃，250 r·min-1搖床培養11 h.轉接1 mL 一級種子液于裝有70 mL M 培養基的500 mL 錐形瓶中，相同條件下培養9 h，作為表達hEGF 培養的二級種子.

1.3.2 發酵罐培養

發酵罐裝入2.36 L MP 培養基，接入140 mL二級種子液.培養條件:攪拌轉速為 400 r·min-1，通氣量為4 L·min-1，溫度為37 ℃.通氣量和攪拌速率根據溶解氧(DO)進行手動調整，以保證整個培養的過程中溶解氧在20%以上.用14%氨水控制培養基的pH 值，生長期控制為7.0，表達期控制為7.8.在實驗過程中及時測定發酵液中銨離子濃度，當其缺乏時手動補加100 g·L-1的氯化銨培養基.

1.4 分析方法

菌體濃度測定采用濁度法，將培養液適當稀釋后測A600，按標準曲線計算菌體干質量.葡萄糖含量采用葡萄糖測定試劑盒(上海科欣生物技術研究所)測定.銨離子濃度采用Berthelot 法［7］比色測定.磷酸鹽采用磷鉬藍法［8］測定.乙酸測定采用氣相色譜法，儀器型號為GC112A(上海分析儀器廠)，以Chromosorb101 作為固定相.人表皮生長因子(hEGF)測定采用Schagger 等改進的分離小分子肽的tricine-tris 系統［9］分離，考馬斯亮藍染色，用圖像分析系統(復日生物電泳圖像分析系統，上海)和分析軟件(Smart View 分析軟件)進行掃描定量.

2 結果

2.1 大腸桿菌DB15(pAET-8)表達hEGF 培養過程

大腸桿菌DB15(pAET-8)表達hEGF 的培養過程［4］分為3 個時期(見圖1):Ⅰ期為分批培養階段，即從發酵開始到初糖耗完，以溶解氧跳升為結束標志;Ⅱ期為指數生長期，即初始葡萄糖耗盡后按照指數流加方式流加葡萄糖，控制菌體比生長速率在0.26 h-1，直到菌體質量濃度達到10.2 g·L-1，此時培養基中的磷含量已降低至足以誘導hEGF 的表達;Ⅲ期為表達期，添加0.22 g·L-1氯化鈣，并以恒速方式(補糖速率為6.61 g·h-1)流加補料培養基，直到發酵結束.該補料分批培養過程記為FB-1，菌體質量濃度、乙酸含量、磷質量濃度、菌體含磷量和葡萄糖比消耗速率(Qs)和hEGF 產量的變化趨勢如圖1 所示.

圖1 大腸桿菌DB15(pAET-8) 表達hEGF 的培養過程(FB-1)

在分批培養階段(Ⅰ期)，大腸桿菌DB15(pAET-8)以0.47 h-1的最大比生長速率生長，6.88 h時初始葡萄糖耗盡，溶解氧跳升，此時乙酸含量為0.17 g·L-1.在Ⅱ期前期，殘余葡萄糖含量一直為零，且無乙酸產生;但在Ⅱ期接近尾聲時，磷元素已成為菌體生長的限制元素，造成乙酸積累，使得Ⅱ期結束時乙酸的質量濃度達到0.26 g·L-1.在表達階段(Ⅲ期)，無機磷(Pi)的質量濃度維持在2 mg·L-1左右，但13.14～21.63 h時菌體質量濃度仍有明顯的增加，由10.6 g·L-1增加至13.1 g·L-1.由于補料培養基中并不含有無機磷，因而，此階段菌體質量濃度的增加是以降低菌體含磷量為代價的，其由32.3 mg·g-1降低至26.0 mg·g-1(見圖1).此階段hEGF 合成速率為12.1 mg·L-1·h-1，且沒有乙酸積累.24.2 h后菌體質量濃度無明顯增加，hEGF 的生產速率降低至8.9 mg·L-1·h-1，且乙酸生成速率增加.至培養結束時，hEGF 和乙酸的質量濃度分別為207 mg·L-1和0.77 g·L-1.

2.2 表達階段流加不同物質對hEGF 表達的影響

磷元素是微生物細胞中許多含磷細胞成分，如核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷(ATP)、輔酶的重要組成元素，在遺傳代謝、生長發育、能量供應等方面都是不可缺少的.在大腸桿菌DB15(pAET-8)表達hEGF 階段，磷元素含量一直處于限制狀態，這必然會對菌體生理代謝及hEGF 表達造成影響.因此，筆者考察了表達階段流加不同物質——磷酸鹽、蛋白胨和酵母抽提物等對大腸桿菌DB15 (pAET-8)表達人表皮生長因子的影響.

2.2.1 磷酸鹽

表達階段后期菌體質量濃度不再增加時，hEGF 生產速率明顯降低.因此，在表達階段限制性流加磷酸鹽，以維持菌體的生長，但保持培養液的磷限制，考察了其對hEGF 表達的影響.

培養條件與FB-1 相同.表達階段以8.49 g·h-1恒速流加補料培養基，同時以12 mg·h-1的流速流加無機磷，記為FB-2.整個過程各指標的變化趨勢見圖2，并與FB-1 過程進行比較.

在野生型大腸桿菌中，phoA 編碼的堿性磷酸酯酶的合成在磷過量培養基中被阻遏，而在磷限制培養基中被去阻遏.phoA 啟動子的誘導與胞內磷含量無關，而由胞外無機磷的含量控制［10］.雖然在表達階段流加了磷酸鹽，但培養基中無機磷含量及表達階段初期菌體含磷量等均與對照FB-1接近(見圖2(b)).因此，流加磷酸鹽并未影響phoA 表達系統啟動表達hEGF.此外，在表達階段恒速流加磷酸鹽，不但增加了表達初期菌體的比生長速率，而且延長了菌體生長期，使得菌體質量濃度在27 h 后仍有明顯的增加(見圖2(a)).與FB-1 相比，表達期流加磷酸鹽使得最終菌體質量濃度提高了31%.盡管葡萄糖比供應速率較對照提高了0.027 g·g-1·h-1，但hEGF 的表達量比對照FB-1 減少了57%，僅為90 mg·L-1.因此，在表達階段僅僅補加磷酸鹽對hEGF 的表達不但無益，反而有害.此外，在表達階段后期流加磷酸鹽也未能改善hEGF 的表達.

圖2 表達階段流加磷酸鹽對hEGF 生產的影響(FB-2)

2.2.2 蛋白胨

蛋白胨中含有少量無機磷，而且在滅菌過程中部分有機磷會轉化為無機磷;同時，蛋白胨還含有各種氨基酸，可以為蛋白翻譯提供前體.因此，在表達期間流加蛋白胨，考察了其對hEGF 表達的影響.

培養條件與FB-1 相同.表達階段以6.95 g·h-1恒速流加補料培養基(在26 h 時提高至10.16 g·h-1)，同時以1.23 g·h-1的速度流加蛋白胨，記為FB-3.整個過程各指標的變化趨勢見圖3.

滅菌后蛋白胨含有少量的磷酸鹽，但整個表達階段磷的質量濃度維持在較低水平，菌體含磷量也與對照FB-1 接近，因此并未影響phoA 表達系統的誘導表達.與對照FB-1 相比，流加蛋白胨延長了菌體生長時間，同時培養結束時菌體質量濃度提高了約23%.盡管在表達階段流加蛋白胨可以為hEGF 合成和菌體生長提供各種氨基酸，但hEGF 表達水平和表達速率卻有所降低，hEGF比生產速率則降低得更多.表達階段后期乙酸含量略高于同期對照，與較高的葡萄糖比供應速率有關.

2.2.3 酵母抽提物

酵母抽提物不但含有無機磷和各種氨基酸，而且還含有核苷酸及微量元素，它在培養過程中起到非常重要的作用，如減少乙酸生成、增強培養基緩沖能力、促進菌體生長和外源蛋白表達等［11］.因此，在表達期間流加酵母抽提物，考察了其對hEGF 表達的影響.

圖3 表達階段流加蛋白胨對hEGF 生產的影響(FB-3)

圖4 表達階段流加酵母抽提物對hEGF 生產的影響(FB-4)

培養條件與FB-1 相同.表達階段以6.57 g·h-1恒速流加補料培養基(在26.56 h 時提高至8.82 g·h-1)，同時以1.32 g·h-1的流速流加酵母抽提物，記為FB-4，其過程曲線見圖4.

酵母抽提物滅菌后含有少量的磷酸鹽，與流加磷酸鹽和蛋白胨的培養過程類似，流加酵母抽提物不但增加了表達階段初期菌體的比生長速率，而且延長了菌體生長時間，同時使得培養結束時菌體質量濃度提高了19%，但整個過程中磷酸鹽質量濃度維持在較低水平，表達階段菌體含磷量也與對照FB-1 接近，因此并未影響phoA 表達系統的誘導表達.培養結束時，hEGF 表達水平達到250 mg·L-1，明顯高于在表達階段流加磷酸鹽時hEGF 的表達水平，這是因為酵母抽提物可以為菌體生長和合成hEGF 提供氨基酸和核苷酸，而在基本培養基中這些都需要由葡萄糖從頭合成.在表達階段前期，2 個過程的葡萄糖比供應速率都在0.20 g·g-1·h-1左右，hEGF 的生產速率也基本一致，但FB-4 的菌體質量濃度高于對照FB-1，而hEGF 的比生產速率低于FB-1.

對照FB-1 在24 h 左右即開始有乙酸積累，而FB-4 培養過程中乙酸含量幾乎一直為零.活細胞計數表明:流加酵母抽提物使得表達期的活菌數降低較少，表明流加酵母抽提物減輕了表達hEGF 所引起的細胞代謝負荷，從而減少了乙酸的生成［11］;同時，表達階段后期hEGF 表達速率也未有明顯的降低.培養過程中補入的氨水量也有所減少，這是因為大腸桿菌在利用復合氮源作為碳源時可以釋放出氨［11］，從而減少了控制pH所需的氨水.

FB-4 培養過程中幾乎沒有乙酸產生，表明葡萄糖可能不足，提高表達階段葡萄糖供給速率后hEGF 表達速率無明顯改善，反而造成了表達階段后期乙酸的積累(數據未列出).

3 討論與結論

phoA 表達系統不僅具有分泌表達系統的優點，而且是相對經濟的表達系統之一，只需培養基中磷含量較低即可.但是作為細胞生長的必需元素，磷限制會影響細胞的生理和代謝.在表達階段單獨流加磷酸鹽雖然增加了表達初期菌體的比生長速率，延長了菌體生長期，提高了菌體質量濃度，但是hEGF 產量卻比對照組減少了57%.大腸桿菌在基本培養基中表達hEGF 時需要從頭合成各種氨基酸，而過多的菌體生長會消耗部分能量和氨基酸前體，由此推測氨基酸合成可能是hEGF表達的限速步驟.在表達階段流加蛋白胨不但可以補充無機磷，同時也可以為hEGF 合成和菌體生長提供各種氨基酸，但hEGF 表達水平和表達速率卻有所降低.酵母抽提物不但含有無機磷和各種氨基酸，而且還含有核苷酸及微量元素，但是在表達階段流加酵母抽提物也未能提高hEGF 表達水平.由此表明，氨基酸或核苷酸合成并不是hEGF 表達的限速步驟.

蛋白質的合成是一個高能耗的過程，延伸的肽鏈每增加一個氨基酸需消耗1 個ATP 和3 個三磷酸鳥苷(GTP)［12］，是細胞內最耗能的一個過程.此外，質粒的復制也需要一定的能量，質粒越大，拷貝數越多，所需的能量就越多［13］.因此，在過量表達外源蛋白的重組大腸桿菌中，能量供給往往受到限制［14］.在大腸桿菌DB15(pAET-8)表達hEGF 階段，磷元素一直處于限制狀態，而磷限制是非常強的解偶聯劑［15］.在磷限制條件下，葡萄糖運輸、三羧酸循環(TCA 循環)及呼吸鏈中的基因轉錄水平均被下調，而糖酵解途徑和還原型輔酶Ⅰ(NADH)脫氫酶基因則被上調［12］.大腸桿菌在磷限制條件下蛋白質表達分析表明:sucC，sucB，gltA 和icdE 等編碼的TCA 循環中的酶，以及丙酮酸脫氫酶亞基(AceF)的表達水平降低了2～4 倍;而gnd 編碼的磷酸戊糖呼吸途徑(PP 途徑)中6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和pfkB 編碼的糖酵解途徑(EMP 途徑)中磷酸果糖激酶-2 單體的表達水平則分別增加了4.98 和3.89 倍［16］.此外，Bacillus subtilis 在不同營養限制下的代謝流分布結果表明:與碳源或氮源限制相比，磷限制條件下的TCA 循環流量大大降低，而流向乙酸等溢流代謝物的流量則大大提高［17］.同時，大腸桿菌在磷限制條件下下調了TCA 循環和呼吸鏈活性［12］，從而減少了ATP 的形成.因此，提高大腸桿菌DB15(pAET-8)合成ATP 的能力或許是提高hEGF 表達的關鍵.

此外，合成精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、天門冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺及纈氨酸途徑的基因轉錄水平在磷限制條件下被下調［15］，這在一定程度也會影響hEGF 在基本培養基中的表達.

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