護卵湯對GnRHa超排卵大鼠卵巢細胞凋亡及活胎率的影響

申可佳，熊 桀，尤昭玲，雷 磊，邱苒苒，游 卉，付靈梅

（1 湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208；2 湖南中醫藥大學附屬一醫院，湖南 長沙410208）

卵巢內顆粒細胞-卵母細胞及顆粒細胞-卵泡膜細胞的信號交流是卵母細胞發育成熟的重要條件，顆粒細胞及卵泡膜細胞的生長或凋亡對卵泡發育及卵母細胞的質量起著舉足輕重的作用。我們的前期工作發現護卵湯能改善促性腺激素釋放激素（GnRHa）超排卵大鼠的卵泡發育及卵子質量，影響體內生殖激素水平[1-2]，本實驗進一步觀察護卵湯對GnRHa 超排卵大鼠卵巢細胞凋亡及妊娠結局的影響。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠90只，體質量為180～220 g。第3 周購入成年雄性大鼠20 只。以上動物均由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物合格許可證號：SCXK（湘）2009-0004。

1.1.2 藥物 護卵湯顆粒，由廣東一方制藥有限公司生產提供，每劑的總質量為17.1 g，相當于生藥量116 g（熟地黃10 g，生地黃10 g，沙參10 g，石斛10 g，山藥10 g，蓮子肉10 g，桑椹子10 g，覆盆子10 g，菟絲子10 g，月季花10 g，蓮心3 g，肉蓯蓉10 g，甘草3 g）；注射用促性腺激素釋放激素（Gn-RHa）：馬鞍山豐原制藥有限公司生產，批號1005265；注射用尿促性腺激素（HMG）：中國麗珠集團麗寶生物化學制藥有限公司生產，批號1007234；注射用絨毛膜促性腺激素（HCG）：中國麗珠集團麗寶生物化學制藥有限公司生產，批號1006137。

1.1.3 試劑 細胞凋亡檢測試劑盒，4%多聚甲醛，磷酸鹽緩沖液（PBS），蒸餾水，雙氧水（H2O2），SABC染色液，DAB 顯色液，蘇木素，25%烏拉坦等，購自武漢Boster 公司、湖南麗欣生物有限公司或自己配制。

1.1.4 儀器 光學顯微鏡（日本Olympus）；石蠟切片機（英國Shandon325）；Motic B5 顯微圖像攝相系統（麥克奧迪實業集團公司）；圖像分析軟件（美國Image-Pro Plus 6.0）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方法 將大鼠隨機分為5組：正常組，模型組，護卵湯低、中、高劑量組，各組給予正常喂養，均在每天上午7:30～8:30 行陰道涂片、染色及鏡檢。各組雌鼠均在陰道涂片發現進入動情后期當天開始用藥[1]。大鼠用藥劑量參照徐叔云等[3]方法，按70 kg 成人體表面積換算。其中模型組模仿人類GnRHa 長方案建立超排卵大鼠模型（從動情后期當天開始，每天腹腔注射GnRHa 2.7 μg/200 g，連續注射9 d，第9 天同時注射HMG 4.1 IU/200 g 1 次，48 h 后注射HCG 180 IU/200 g 1 次）；護卵湯各劑量組在模型組基礎上加用不同劑量的護卵湯（低、中、高劑量組從動情后期當天開始至第11 天，每天上午分別給予護卵湯1.6、3.1、6.2 g/kg 灌胃），模型組、正常組每天在相應時間給予等量生理鹽水腹腔注射和灌胃。

1.2.2 標本采集 在注射HCG 后4 h 用25%烏拉坦麻醉大鼠，動物天平稱體質量后固定于鼠板，剪開大鼠腹膜，沿雙側子宮角上行，分別找到雙側卵巢，摘取雙側卵巢并去除表面脂肪組織。每組余下的雌鼠在注射HCG 后當天與雄鼠以2∶1 比例合籠過夜，次日早晨7∶00 檢查雌鼠，若發現陰栓或陰道分泌物涂片中有精子記為孕1 d，常規飼養至孕12 d，用25%烏拉坦麻醉后固定于鼠板，剪開大鼠腹膜，取出雙側子宮，計數宮內活胎數和總胎數，計算每組妊娠大鼠的總活胎率=[總活胎數/總胎數]×100%。

1.2.3 卵巢細胞凋亡檢測 將取出的卵巢組織按TUNEL 法進行細胞凋亡檢測操作，置于顯微鏡下觀察，細胞核有棕黃色顆粒者為凋亡細胞，未凋亡細胞呈藍色。使用圖像分析軟件觀察結果，隨機選取5個高倍視野（400 倍），計數200 個細胞中的凋亡細胞數，并計算細胞凋亡率[4]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HCG 注射后當日各組大鼠卵巢細胞凋亡率

模型組及護卵湯各劑量組的卵巢體細胞凋亡率比正常組顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01）。護卵湯各劑量組的卵巢體細胞凋亡率均比模型組降低，差異有統計學意義（P＜0.01 或0.05）。結果見表1及圖1。

表1 HCG日各組大鼠卵巢體細胞凋亡率 （n=8，±s）

表1 HCG日各組大鼠卵巢體細胞凋亡率 （n=8，±s）

注：與模型組比較★P＜0.05，★★P＜0.01；與正常組比較▲▲P＜0.01。

組 別正常組模型組護卵湯低劑量組護卵湯中劑量組護卵湯高劑量組藥物劑量（g／kg）--1.6 3.1 6.2凋亡率（%）5.50±1.10 16.75±3.06▲▲13.13±2.95★▲▲12.56±2.69★▲▲11.13±2.80★★▲▲

2.2 孕12 d 妊娠大鼠的總活胎率

孕12 d 各組妊娠大鼠的總活胎率如表2所示，經統計學分析各組之間的數據沒有統計學意義。

表2 孕12 d 各組大鼠妊娠總活胎率比較

圖1 各組大鼠卵巢細胞凋亡光鏡圖（TUNEL ×400）

3 討論

細胞凋亡（apoptosis）是在特定信號的誘導下，一系列基因按程序時空順序表達，引起細胞內死亡級聯反應，導致自主性程序性的細胞死亡。在成人的卵巢組織，細胞凋亡發生在閉鎖卵泡或發育異常的卵泡，正常健康的卵泡不會觀察到細胞凋亡現象；且細胞凋亡首先發生在顆粒細胞中，隨后也出現于膜細胞層中，其主要累及的是卵巢顆粒細胞和間質細胞而非卵母細胞[6]。由于細胞凋亡早期就有DNA斷裂，故TUNEL 法可以檢測到早期的細胞凋亡，本實驗采用TUNEL 法檢測卵巢體細胞凋亡，具有靈敏度高、操作簡單快速、觀察方便（可用光學顯微鏡觀察實驗結果）等優點。多項研究表明[7-12]，卵泡顆粒細胞凋亡率與卵母細胞的質量及胚胎的體外發育潛能相關，與IVF 獲卵數、受精率及妊娠結局相關，超排卵周期增高的卵泡顆粒細胞凋亡率會影響卵子質量及妊娠率。本實驗結果發現模型組及護卵湯各劑量組大鼠的卵巢體細胞凋亡率比正常組顯著增高，證實超排卵周期卵巢體細胞凋亡率較自然周期增高，與文獻報道一致，并且是導致模型組大鼠排卵前優質卵泡率較正常組下降、卵母細胞超微結構異常[1]的原因。而護卵湯各劑量組均能有效減少GnRHa 超排卵大鼠卵巢體細胞的凋亡，這提示中藥護卵湯參與GnRHa 超排卵治療，能促進卵泡發育及提高卵母細胞的質量，與前期結果相符[1]。觀察孕12 d 各組妊娠大鼠的總活胎率發現，模型組的總活胎率低于其它各組，但經統計學分析無統計學意義，各組之間活胎率差異性不顯著可能與樣本量偏小有關，在下一步的實驗中增加樣本例數應該更能說明護卵湯對各組大鼠活胎率的影響

綜合本次實驗和前期實驗結果可得出結論：GnRHa 超排卵增加大鼠卵巢體細胞凋亡，對卵泡發育有不利影響；而護卵湯能減少GnRHa 超排卵大鼠卵巢體細胞的凋亡，促進卵泡發育及提高卵母細胞的質量。

［1］申可佳，尤昭玲，熊 桀，等.護卵湯對GnRHa 超排卵大鼠卵巢形態的影響［J］.湖南中醫藥大學學報，2012，32（9）：25-28.

［2］申可佳，熊 桀，尤昭玲，等.護卵湯對GnRHa 超排卵大鼠血清生殖激素的影響［J］.湖南中醫藥大學學報，2012，32（12）：

［3］徐叔云，卞如濂，陳 修，等.藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛生出社，1982：1 184.

［4］王 玲.從調節卵巢細胞凋亡探討左歸丸治療免疫性卵巢早衰的機制［D］.廣州中醫藥大學，2007.

［5］丁 峰，陳士嶺，邢福祺.卵泡閉鎖調控機制研究進展［J］.國外醫學·遺傳學分冊，1999，22（2）：88-91.

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［7］Hutt K J，E A MeLanghlin，M K Holland.Kit ligand and c-Kit have diverse roles during mammalian oogenesis and folliculogenesis［J］.Mol Hum Reprod，2006，12（2）：61-69.

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［11］劉 景.顆粒細胞MDA、SOD 水平和凋亡率對卵子質量和IVF-ET 結局的影響［D］.中南大學，2008.