SB203580在電壓依賴(lài)性鉀離子通道阻斷劑4-氨基吡啶增強(qiáng)大鼠低氧高二氧化碳性肺血管收縮中的作用*

馬迎春， 陳海娥， 黃林靜， 何金波， 王淑君， 陳 丹， 汪 洋，2， 王萬(wàn)鐵，2△

(溫州醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，2缺血/再灌注損傷研究所，浙江溫州325035;3赤峰上京內(nèi)分泌專(zhuān)科醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰024000)

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)上鉀離子通道功能異常在低氧性肺血管收縮及血管重構(gòu)中均發(fā)揮重要作用［1］，其中最重要且研究較多的是電壓依賴(lài)性鉀離子通道。近年來(lái)有關(guān)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和低氧之間的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。p38 MAPK是MAPK信號(hào)家族一重要成員，可被許多應(yīng)激刺激(包括低氧、活性氧)及某些G蛋白偶聯(lián)受體激活，引起一系列生物化學(xué)反應(yīng)［2-3］。本室先前研究［4］表明:在急性低氧高二氧化碳條件下，p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580能減弱二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)的II期持續(xù)收縮反應(yīng)。那么p38 MAPK信號(hào)通路在低氧高二氧化碳性肺血管收縮(hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction，HHPV)中發(fā)揮的作用與鉀離子通道是否有關(guān)系，目前未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究采用電壓依賴(lài)性鉀離子通道(voltage-dependent K+channel，KV)阻斷劑——4-氨基吡啶(4-aminopyridione，4-AP)及SB203580在急性低氧高二氧化碳條件下孵育SD大鼠離體二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)，動(dòng)態(tài)觀察血管環(huán)收縮張力的變化，探討KV和p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)急性HHPV的影響。

材料和方法

1 動(dòng)物和試劑

清潔級(jí)雄性SD大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(浙)2010-0044］。SB203580購(gòu)自Biosource，DMSO購(gòu)自上海申工生物技術(shù)有限公司，重酒石酸去甲腎上腺素購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司，乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和4-AP購(gòu)自 Sigma。其余均為市售分析純。

2 大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)灌流模型的復(fù)制

SD大鼠36只，體重(300±20)g，隨機(jī)均分成6組(n=6)，按照本室先前報(bào)道的方法［4］制備大鼠低氧高二氧化碳性二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)灌流模型，并平衡動(dòng)脈環(huán)，檢測(cè)內(nèi)皮的完整性。

3 電壓依賴(lài)性鉀離子通道阻斷劑4-AP及p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580對(duì)HHPV的影響

在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中，分別用4-AP及4-AP和SB203580聯(lián)合孵育二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)20 min，動(dòng)態(tài)觀察藥物處理對(duì)HHPV的影響。所有二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)隨機(jī)分為:(1)常氧組(N組);(2)低氧高二氧化碳組(H組);(3)低氧高二氧化碳+DMSO組(HD組);(4)低氧高二氧化碳 +4-氨基吡啶組(4-AP組);(5)低氧高二氧化碳+SB203580組(SB組);(6)低氧高二氧化碳+4-氨基吡啶+SB203580組(4-AP+SB組)。N組和H組不做藥物處理，HD組、4-AP組、SB組和 4-AP+SB組分別用 DMSO(0.05%)、4-AP(10-3mol/L)、SB203580(10-5mol/L)和4-AP(10-3mol/L)+SB203580(10-5mol/L)孵育20 min，然后按照低氧高二氧化碳反應(yīng)性測(cè)定方法(除N組外)檢測(cè)肺動(dòng)脈環(huán)張力的變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)(張力變化率)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnett's T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 低氧高二氧化碳對(duì)二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)張力的直接影響

N組持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣體60 min，張力變化率(tension percentage change，P%)未見(jiàn)明顯變化，見(jiàn)圖1A、表1。H組持續(xù)通入92%N2+8%CO2混合氣體60 min，其張力曲線呈雙相性收縮(biphasic vasoconstriction):即在急性低氧高二氧化碳條件下1～5 min內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)短暫、明顯的收縮峰(I期快速收縮，phase I vasoconstriction)，5 ～15 min此收縮峰表現(xiàn)為較明顯的舒張(I期舒張，phase I vasodilation)，15～20 min后又出現(xiàn)緩慢、持久的收縮(II期持續(xù)收縮，phase II vasoconstriction);H組二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)的 P%與常氧組相比，差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖1B、表1。HD組作為溶劑對(duì)照組，與H組相比，二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)P%變化不明顯(P＞0.05)，見(jiàn)圖1C、表1。

2 4-AP在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中對(duì)二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)HHPV的影響

選用4-AP孵育二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)時(shí)發(fā)現(xiàn)，4-AP可增強(qiáng)二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)的HHPV，尤其是II期持續(xù)收縮，與HD組相比，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)圖1D、表1。

3 SB203580在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中對(duì)二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)HHPV的影響

用SB203580孵育二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)時(shí)發(fā)現(xiàn)，SB203580可明顯緩解急性低氧高二氧化碳引起的二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)II期持續(xù)性收縮，但I(xiàn)期快速收縮沒(méi)有明顯變化，與HD組相比，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)圖1E、表 1。

4 4-AP與SB203580聯(lián)合應(yīng)用在HHPV中的作用

用4-AP與SB203580聯(lián)合孵育二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)，發(fā)現(xiàn)SB203580能減弱4-AP所致的肺動(dòng)脈環(huán)收縮幅度，使血管環(huán)張力下降。在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中，4-AP+SB組I期收縮和I期舒張變化不明顯，但收縮峰值較HD組明顯下降，II期持續(xù)收縮逆轉(zhuǎn)為舒張狀態(tài)(P＜0.05或P＜0.01);4-AP+SB組二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)II期持續(xù)收縮顯著緩解，與HD組、4-AP組和SB組相比，均有顯著差異(P＜0.05或 P＜0.01)，見(jiàn)圖1F、表1。

Figure 1.Dynamic changes of the tension of the second-order pulmonary artery rings in the six groups.A:control group;B:hypoxia hypercapnia group;C:hypoxia hypercapnia+DMSO incubation group;D:hypoxia hypercapnia+4-AP group;E:hypoxia hypercapnia+SB203580 incubation group;F:hypoxia hypercapnia+4-AP+SB203580 incubation group.圖1 6組二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)張力的動(dòng)態(tài)變化

討 論

低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)的發(fā)生機(jī)制與PASMCs膜電位(membrane electricity，Em)變化密切相關(guān)。PASMC的張力主要受Em調(diào)控，膜去極化可激活L型鈣通道(L-type voltage-dependent calcium channels，L-VDC)，導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，胞質(zhì)Ca2+濃度升高，觸發(fā)興奮收縮偶聯(lián)機(jī)制，引起平滑肌細(xì)胞收縮。而膜電位的大小取決于細(xì)胞膜上各種離子通道的活性，其中鉀通道的作用至關(guān)重要。PASMCs上與HPV相關(guān)的鉀通道主要有以下4種:(1)KV，包括延遲整流性鉀通道(delayed rectifier K+channels，KDR)、瞬時(shí)外向鉀通道(transient out ward K+channels，Kto)及緩慢激活的非失活性鉀通道(non-inactivating K+channels，KN);(2)鈣激活性鉀通道(calcium-activated potassium channels，KCa)，KCa通道根據(jù)電導(dǎo)值的不同分為高(BKCa)、中(IKCa)、低電導(dǎo)(SKCa)的鈣激活鉀通道，其中在血管平滑肌上分布廣泛的是BKCa;(3)內(nèi)向整流性鉀通道(inward rectifier potassium channels，Kir);(4)ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channels，KATP)，KATP是由內(nèi)向整流性孔區(qū)(Kir)和磺酰脲受體(sulfonylurea receptor，SUR)組成的八聚體，特異性阻斷劑是格列苯脲(glybenclamide，Gly)。還有一種雙孔區(qū)鉀通道(two-pore potassium channels，Kt)正在研究中［5-6］。低氧可使 KV及 Kt受抑制，導(dǎo)致膜發(fā)生除極，引起L-VDC開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流增加，觸發(fā)興奮收縮偶聯(lián)機(jī)制［7］。洪志剛等［8］在離體大鼠肺的研究中指出，有些鉀離子通道阻斷劑可增加低氧狀態(tài)下肺血管張力進(jìn)而增強(qiáng)HPV，由此我們可以認(rèn)為HPV是通過(guò)對(duì)鉀離子通道的直接調(diào)控引起細(xì)胞膜去極化所致。周敏等［9］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦支持肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上的KV在低氧性肺血管收縮中起重要作用。因此，我們選用KV的阻斷劑4-AP孵育急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中的二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)，觀察其HHPV的張力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)4-AP孵育的血管環(huán)HHPV的收縮幅度增強(qiáng)，Ⅱ期持續(xù)收縮較明顯。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了KV與HHPV密切相關(guān)，阻斷KV可增強(qiáng)肺動(dòng)脈環(huán)HHPV收縮的幅度。這可能是因?yàn)榉窝艿氖湛s與其血管平滑肌細(xì)胞膜電位變化密切相關(guān)，而膜電位的變化又直接調(diào)控血管張力的變化。

表1 6組二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)張力的動(dòng)態(tài)變化Table 1.The tension percentage changes of the second-order pulmonary artery rings in the six groups(Mean±SD.n=6)

MAPK即絲/蘇氨酸蛋白激酶，是一種細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，它參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種生理反應(yīng)過(guò)程。p38 MAPK通路又稱(chēng)為應(yīng)激激活的MAPK通路，實(shí)驗(yàn)中我們用p38 MAPK通路抑制劑SB203580孵育急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中的二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SB203580可明顯緩解急性低氧高二氧化碳引起的二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)II期持續(xù)性收縮，但I(xiàn)期快速收縮沒(méi)有明顯變化，這與我們之前的研究結(jié)果是一致的［4］。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步研究其與鉀離子通道的關(guān)系，我們用4-AP與SB203580聯(lián)合孵育二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)，發(fā)現(xiàn)在低氧高二氧化碳條件下II期持續(xù)收縮明顯下降，說(shuō)明p38 MAPK信號(hào)通路可能在鉀離子通道受阻斷引起的II期持續(xù)收縮中發(fā)揮著重要的作用。因此我們有理由認(rèn)為SB203580能夠緩解因KV阻斷而引起的HHPV。

在急性低氧高二氧化碳的條件下MAPK信號(hào)通路被激活，引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮，而在此過(guò)程中鉀離子通道呈現(xiàn)出受阻斷的關(guān)閉狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化而產(chǎn)生細(xì)胞收縮。由此我們可以推斷MAPK通路與鉀離子通道之間可能存在著一定的聯(lián)系，我們通過(guò)抑制 p38 MAPK通路緩解肺動(dòng)脈的HHPV，而在此過(guò)程中鉀離子通道可能處于開(kāi)放狀態(tài)，從而可以使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位趨于復(fù)極化狀態(tài)，減少鈣離子內(nèi)流，從而緩解其收縮程度。

綜上所述，KV阻斷劑4-AP可增強(qiáng)HHPV的作用，抑制p38 MAPK通路可以緩解4-AP引起的肺動(dòng)脈HHPV。p38 MAPK信號(hào)通路的參與可能是電壓依賴(lài)性鉀離子通道調(diào)節(jié)低氧高二氧化碳肺動(dòng)脈高壓形成的重要機(jī)制之一，它們之間具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。