聯合檢測P504S、VEGF和MVD在腎細胞癌中的表達及臨床意義

廖勇，黃建林，閻洪濤，董丹丹，蔣建春

（1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院泌尿外科，成都610072；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院病理科，成都610072；3.成都中醫藥大學，成都610075）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系常見的惡性腫瘤之一，其生物學行為表現較復雜。腫瘤血管是惡性腫瘤生長、轉移的基礎，微血管密度（MVD）常用來評價腫瘤的血管生成，而血管內皮生長因子（VEGF）可調控血管的生成，其表達與 MVD存在相關性。α－甲酰基輔酶A消旋酶（P504S）是一種新近確認的特異性分子標記物，在許多腫瘤如前列腺癌、RCC、結腸癌、乳腺癌等都有較高的表達，可能與腫瘤的發生、發展存在密切關系。本研究應用免疫組織化學標記菌葡萄糖聚合物（labeled dextran polymer，LDP）法對RCC組織中P504S、VEGF的表達及MVD進行了觀察比較，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2003年1月～2010年12月于四川省人民醫院泌尿外科行手術且病理證實為RCC的患者67例，患者中位年齡48.1歲（25～69歲），其中男42例，女25例。所有病例術前均未接受化療、放療和免疫治療。按WHO1997年病理學分級標準：G1級17例，G2級39例，G3級11例；按2002年AJCC的 TNM 分期標準：I期（T1）16例，Ⅱ期（T2）21例，Ⅲ（T3）19例，Ⅳ期（T4）11例。手術后對患者進行隨訪，隨訪年限1～7年，其中有完整隨訪資料的患者共57例。對照組為10例因腎外傷等原因行腎臟手術的成年患者，標本為切除的非腫瘤腎組織。

1.2 病理方法

所有病理標本均用15%甲醛液浸泡、固定，常規取材、脫水和石蠟包埋，連續4μm厚切片備染。分別進行常規HE染色、免疫組化P504S、VEGF和CD34染色。一抗分別為兔抗人P504S多克隆抗體（福州邁新公司產品）、單克隆抗體VEGF（工作濃度1∶100，Zymed公司產品）、抗CD34單克隆抗體（工作濃度1∶50，DAKO公司產品），二抗均為EnvisionTM檢測系統（DAKO公司產品）。采用免疫組織化學LDP法進行檢測。陽性對照采用已知的陽性切片，陰性對照采用PBS液代替一抗。

1.3 結果判斷標準

1.3.1 P504S染色 陽性為細胞質著色。分級標準：陽性腫瘤細胞＜5%為（－），5%～25%為（＋），26%～50%（＋＋），＞50%為（＋＋＋）。

1.3.2 VEGF染色 陽性表達為腫瘤細胞漿出現棕黃色反應物。以染色強度和陽性細胞百分率得分之和判定VEGF的表達強度：總分0～3為低表達，4～6為高表達。其中1）染色強度：陰性為0，弱陽性為1，陽性為2，強陽性為3；2）陽性細胞百分率：陽性細胞0%為0，＜25%為1，26%～50%為2，＞50%為3。

1.3.3 MVD評估 采用CD34染色，陽性為任何血管內皮細胞（包括單個內皮細胞）的細胞核和／或細胞漿和／或細胞膜中出現棕黃色染色。評估MVD分兩步，先將CD34染色的切片置于低倍鏡下（×100）觀察，確認血管數最高的區域；然后隨機選擇5個微血管密集區域于高倍顯微鏡下（×400）觀察，并記錄微血管數（MVC），取其平均值即為MVD值，數據用均數±標準差（±s）表示。

1.4 統計學方法

運用SPSS 17.0軟件進行統計分析。兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較及計數資料采用方差分析和χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P504S在RCC及正常腎組織中的表達

P504S呈彌漫胞質陽性，在正常腎組織的近曲小管和遠曲小管表達，而集合管和腎小球為陰性。其中僅1例呈陽性表達，且為弱陽性。P504S在67例RCC組織中有44例呈陽性表達，P504S在RCC與正常腎組織中表達差異有統計學意義（P＜0.01）（見表1）。

表1 RCC與正常腎組織中P504S的表達［n（%）］

2.2 VEGF的表達和RCC MVD分布

67例RCC組織中VEGF陽性表達與10例正常腎組織比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）。67例RCC的平均MVD為（52.75±12.76），10例正常腎組織為（15.63±6.32），前者明顯較高，差異有統計學意義（P＜0.01）。從形態分布上看，RCC微血管呈網狀、管狀散在或彌漫性，而正常腎組織微血管形態及分布相對均勻、規范。此外，不同區域MVD也不相同，在腫瘤間質和腫瘤組織邊緣部血管豐富，而在腫瘤中央近壞死區域，血管分布稀疏或者缺如（見表2）。

表2 RCC與正常腎組織中VEGF的表達［n（%）］和MVD

2.3 P504S表達與VEGF的表達及MVD的關系

P504S表達與VEGF表達、腫瘤MVD之間存在正相關性，P504S陽性表達組（n＝44）：VEGF陽性表達38例，陰性表達6例，MVD值為（58.61±21.37）；而P504S陰性表達組（n＝23）：VEGF陽性表達14例，陰性表達9例，MVD值為（31.25±16.43）。兩組比較差異均有統計學意義（VEGF陽性表達率比較P＝0.017，MVD值比較P＜0.01）（見表3）。

表3 P504S陽性表達與陰性表達中VEGF的表達［n（%）］和MVD

2.4 P504S、VEGF和 MVD與RCC臨床、病理學特點的相關性

按腫瘤不同級別進行分組比較P504S的表達，G1級與G2級、G1級與G3級、G2級與G3級比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。按分期比較，高分期組（T3～T4期）P504S表達明顯高于低分期組（T1～T2期），差異有統計學意義（P＜0.01）。可見，RCC組織中P504S的表達水平與RCC的病理分級和臨床分期均呈正相關。

分析結果表示：各組之間比較，VEGF表達的差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。組織學Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組每兩組之間 MVD比較，差異均有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；臨床分期各組之間 MVD比較，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。所以，VEGF的表達與RCC MVD兩者皆與RCC病理分級、臨床分期有密切關系。

P504S、VEGF的表達與RCC的MVD三者還與RCC有無遠處轉移或淋巴結轉移有關：有遠處轉移組（n＝6）MVD為（89.27±22.14），VEGF低表達0例，高表達6例，P504S低表達0例，高表達6例；無遠處轉移組（n＝61）MVD為（40.13±19.23），VEGF低表達29例，高表達32例，P504S低表達38例，高表達23例，P＜0.01。有淋巴結轉移組（n＝13）MVD為（82.72±19.73），VEGF低表達1例，高表達12例，P504S低表達0例，高表達13例；無淋巴結轉移組（n＝54）MVD為（39.13±17.12），VEGF低表達28例，高表達26例，P504S低表達32例，高表達22例，P＜0.01（見表4）。

2.5 P504S、VEGF和MVD與RCC預后的關系

對有完整隨訪資料的患者研究表明：隨訪5年內死亡者P504S、VEGF和MVD的表達均高于存活5年以上者，兩者比較，差異有統計學意義P＜0.01（見表5）。

表4 P504S、VEGF和MVD與RCC臨床病理學特點的相關性

表5 P504S、VEGF、MVD與術后生存時間的關系

3 討論

3.1 P504S在RCC中表達的意義

P504S基因定位于染色體5p13，全長1 621bp，編碼382個氨基酸，具有在腫瘤組織中特異性表達的特點。P504S是一種新近確認的特異性分子標記物，存在于胞漿內過氧化物酶體和線粒體上，目前學者［1］認為P504S可能與腫瘤的發生、發展存在密切關系。P504S一般在正常組織中無表達，當細胞突變成腫瘤細胞時，細胞內的代謝也發生了變化，在有關基因的調控下該蛋白產物過度表達，致P504S出現陽性。據文獻［2，3］報道，結直腸癌、肝細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、腎腺癌等腫瘤組織中均有陽性表達，在腫瘤的臨床病理診斷中起重要的作用，且與腫瘤的生物學行為及預后有關。

在正常腎組織，P504S表達于近曲小管和遠曲小管，呈弱至中等程度陽性。本實驗中RCC組織中P504S陽性表達率達65.67%，且多呈中等和強陽性表達，提示多數RCC中有β氧化酶大量增加。本研究還發現，P504S的陽性表達與RCC的臨床分期和腫瘤細胞的分化程度均呈現正相關性。而在10例正常腎組織中僅1例呈弱陽性表達，證實P504S對RCC較敏感。因此，P504S可作為RCC診斷和鑒別診斷的重要參考指標。此外，隨訪資料顯示P504S陽性表達率低的患者術后生存期明顯高于陽性表達率高的患者，說明P504S標記物對RCC患者的預后也有一定參考價值。

3.2 VEGF在RCC中表達的意義

腫瘤的血管新生是腫瘤發生發展過程中不可或缺的一個重要環節，已成為許多腫瘤的研究熱點，它包括腫瘤細胞誘導的毛細血管形成以及腫瘤組織中血液循環建立的復雜過程［4］。而新生血管的形成又受多種因子的調控，包括血管生長因子和血管生成抑制因子，其中VEGF的作用尤為突出，它對血管內皮細胞的增殖、遷移和血管構建有較強的調控作用，有研究［5］證實其與腫瘤的分級、分期及預后有關。VEGF是一種典型的外分泌蛋白，它可以與血管內皮細胞的膜受體結合，從而發揮相關功能，而腫瘤組織能繼續生長和轉移的必要內在條件之一就是腫瘤組織中VEGF的高表達。本研究顯示VEGF低表達組的MVD值低于高表達組（P＜0.01），該結果與上述理論是一致的。

本研究結果還顯示，RCC組織中VEGF的表達強度隨RCC病理分級的增高而升高（P＜0.01），說明VEGF的表達與RCC的腫瘤細胞分化程度密切相關；此外，VEGF的表達強度也隨RCC臨床分期的增高升高（P＜0.01），說明VEGF的表達強度與腫瘤的侵襲能力也相關。所以臨床上可將RCC組織中VEGF的表達程度作為一個判斷RCC惡性程度和侵襲能力的指標。

3.3 檢測RCC組織中MVD的臨床意義

人體正常組織血管的增殖受機體嚴格調節，而腫瘤的血管增殖往往是無法控制的［6］，其中最重要的就是微血管（microvessel，MV）的形成。MV包括組織中的微動脈、微靜脈及毛細血管。腫瘤組織中新生的MV發育不成熟，管壁僅為一層常有裂隙的內皮細胞，缺乏基底膜；內皮細胞分泌的纖維蛋白溶解酶又可破壞基質屏障，使腫瘤細胞容易進入MV，經血循環在遠處器官形成轉移灶，所以腫瘤MV是腫瘤血行轉移的重要因素［7］。計數原發腫瘤中瘤內MV數是目前最常使用的量化腫瘤血管生成的方法，而CD34是標記血管內皮細胞特異性最高的標記抗原，檢測MVD多采用CD34染色，本研究也采用此法。

目前研究認為，隨著MVD的增加，腫瘤侵襲能力也會增加；更有學者［7］認為，MV侵犯和血管新生可作為一項預測RCC惡性程度及預后的指標。本研究中以CD34標記MV發現，RCC組織中MV形態和數量各異，密度分布也不均勻；RCC組織中的MVD明顯高于正常腎組織的MVD，差異有統計學意義（P＜0.01）。其次，隨著腫瘤組織學分級和腫瘤臨床分期的增高，RCC中MVD也隨之升高，表明RCC中MVD與腫瘤的惡性程度及其侵襲能力呈正相關性。此外，RCC的MVD與局部淋巴結轉移或遠處轉移密切相關，這些結果均與文獻報道相似。

3.4 P504S表達與VEGF表達及MVD的相關性和臨床意義

本研究結果顯示，RCC組織中P504S的表達與VEGF表達及MVD均呈正相關性，表明VEGF在腎癌中是血管生成調控的關鍵促血管生成因子［8］。新生血管的形成對腫瘤增殖不可缺少，因為其保證了腫瘤代謝的需求。因此，當RCC中VEGF的過表達將導致腫瘤間質MVD增高這一結果，必將導致腫瘤細胞內的代謝也發生變化，致多數RCC中有β氧化酶大量增加，即在有關基因的調控下使P504S蛋白產物過度表達，P504S出現陽性表達。

RCC的生物學行為表現較復雜，在臨床上也難以準確預測其預后。本研究中采用免疫組化LDP對RCC組織中P504S、VEGF及 MVD進行了檢測，同時探討了P504S及VEGF、MVD與RCC預后的關系。隨訪結果發現5年內死亡者P504S表達、VEGF表達以及MVD測值均要高于存活5年以上者（P＜0.01），說明P504S、VEGF表達的強度及MVD數值的變化與RCC的惡性程度及預后密切相關。臨床上通過檢測RCC的P504S、VEGF表達和MVD，有助于判斷腫瘤的惡性程度及預后特點。

綜上所述，P504S、VEGF與 MVD均是反映RCC細胞生物學行為較理想的標記物，臨床上聯合檢測可作為預測RCC惡性程度、轉移及預后的一項重要參考指標。

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