腌制過程中添加木瓜蛋白酶對豬肉糜的影響

叢懿潔，孫為正，崔 春，趙謀明，楊園媛

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510641）

在肉制品加工過程中，腌制是常見工序之一。腌制是通過在肉腌制過程中添加腌制劑以利于加強肉的保存性、形成成熟風味，提高肉的發色性和保水性，施加咸味。腌制劑通常使用食鹽、亞硝酸鈉等發色劑、復合磷酸鹽等保水劑、香辛料和食糖等。肉在腌制中所產生的變化主要有：由蛋白質分解產生組織的柔軟化，生成肽、氨基酸等呈味成分，由脂肪分解生成脂肪酸、醛等風味成分，由糖類分解生成有機酸、乙醇等[1]。通過腌制，組織、風味等特征都由生肉轉化為加工品。肉的腌制已作為重要的加工手段在生產中廣泛應用，其在肉制品加工中占有十分重要的地位。肉類在凍藏過程中硬度變大，色澤變深，水分蒸發產生干耗，導致最終肉品質的劣變，且凍藏過程中蛋白質變性，肉中的內源性酶在低溫下活性降到最低甚至幾乎沒有活性，而內源性酶如組織蛋白酶在肉中的作用極為重要，它們在肉類的成熟過程中扮演重要角色，可引起肉的嫩化及肉中蛋白質降解和風味物質形成[2]。木瓜蛋白酶因其穩定性好，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等均具有強的水解能力，是最常用的植物蛋白酶[3]。國內關于木瓜蛋白酶對肉的研究一般局限在通過測定肉的剪切力來判定肉嫩度的變化，關于腌制過程中添加蛋白酶對肉其他品質的影響尚鮮有報道。肉腌制中添加木瓜蛋白酶，不僅改善肉的質構特性，同時由酶降解肉蛋白形成氨基酸等多種小分子風味物質，更易溶于水中，提高肉的保水性，從而提高生肉糜在冷藏期間的品質；在后期肉熟化過程中，這些氨基酸更易于與肉中添加的糖結合進行美拉德反應，得到新的風味化合物，從而增加肉制品的口感和風味，并且美拉德反應產物具備一定的抗氧化能力，能夠延長肉制品的貨架期[4]。因此，肉制品加工前期加酶腌制對肉糜品質的研究十分有必要，實驗通過在肉糜中添加不同含量的木瓜蛋白酶，測定肉糜水溶性提取物中的總氮和氨氮的含量來確定酶對肉中蛋白的降解作用程度，并對肉糜進行質構、色澤等分析，在一定程度上對凍藏肉中內源酶活性降低形成補缺作用，同時為肉糜的腌制及肉制品的后期加工提供一定的理論依據，對實際肉制品的加工和生產具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料肉 購于華南理工大學后勤綜合樓；木瓜蛋白酶（8.0×105U/g） 廣州裕立寶生物科技有限公司；六偏磷酸鹽、多聚磷酸鹽、焦磷酸鹽等 均為分析純；食鹽、食糖等 均購于華南理工大學后勤綜合樓。

MM12型絞肉機 廣東省韶關市食品機械廠；CT-400型色差儀 柯尼卡美能達光電股份有限公司；TA.XT2i型物性測試儀：配有P/50探頭 美國Micro Stable公司；KDN-102F型自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；TIM 840型甲醛滴定儀 法國Radiometer analytical公司；Dew Point 4TE型水分活度儀 美國Aqualab公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉糜配方（以投料計） 瘦肉∶肥肉=8∶1；食鹽：2%；食糖：15%；復合磷酸鹽（六偏磷酸鹽∶多聚磷酸鹽∶焦磷酸鹽=1∶1∶1）：0.3%；木瓜蛋白酶：0%～0.10%。

1.2.2 測定方法 將原料肉絞碎，所用孔板直徑為6mm，根據以上配方添加腌制劑，滾揉后置于4℃冰箱腌制18h。將腌制好的肉糜分為兩部分，一部分以1∶10比例加蒸餾水，并在8000r/min高速均質1min，10000r/min離心20min，取上清液備用。剩下的肉糜留備用。

清液總氮測定：采用KDN-102F自動定氮儀測定。

清液氨氮測定：采用TIM 840甲醛滴定儀測定。

肉糜色差測定：采用CR-400便攜式色差儀測定CIE L*，CIE a*，CIE b*。

肉糜水分活度測定：采用Dew Point 4TE水分活度儀測定。

肉糜pH的測定：稱取5g腌制好的豬肉糜到小燒杯中，加入45mL蒸餾水，作10倍稀釋，攪拌30min。室溫靜置10min左右，將電位計上的玻璃電極直接插入燒杯中的肉和水混合物內，3～5s內數據穩定后讀數[5]。

肉糜物性指標的測定：采用物性測試儀測定腌制后肉糜的質構特性，參數設定按照文獻[6]稍作調整。具體測定參數如下：探頭P/50；測前速度2mm/s，測中速度1mm/s，測后速度2mm/s，間隔時間5s，數據收集率200點/s，壓縮比50%，觸發力5g，觸發類型auto，每組6個重復。測試完用自帶的軟件Texture Expert Exceed 2.64a內部宏TPA.MAC對測試結果進行處理。

1.2.3 統計分析 實驗數據以平均數±標準差表示，應用SPSS 18.0軟件包對各指標進行分析，差異性分析采用鄧肯（Duncan）法，相關性分析采用皮爾遜（Pearson）法。應用Origin 7.5進行作圖。

表1 TPA實驗主要參數及其定義Table 1 Main parameters and definition of TPA

2 結果與討論

2.1 肉糜水溶性總氮和氨氮的變化

表2 不同添加量的酶對水溶性總氮及氨氮含量的影響Table 2 Effect of different enzyme content on water soluble total nitrogen and ammonia nitrogen

由表2可見，腌制過程中隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，肉糜的水溶性總氮、氨氮含量均顯著升高（p＜0.05），其中總氮含量提高了1.2倍，氨氮含量提高了5倍。由此可知，肉糜在加入少量的酶腌制后發生一定的降解作用，大分子蛋白降解成小分子肽、氨基酸等，這些小分子更易溶于水而被提取出來。且隨著酶添加量的增加，酶的作用效果越明顯，降解作用程度越大，生成的游離氨氮越多。P Gou[7]發現，隨著腌制時間增加，總氮和非蛋白氮含量均顯著升高（p＜0.05）。實驗結果表明，在4℃條件下，木瓜蛋白酶仍具備一定活力，對肉中蛋白降解作用也十分明顯。

2.2 肉糜水分活度的變化

表3 不同添加量的酶對肉糜水分活度的影響Table 3 Effect of different enzyme content on water activity

由表3可以看出，當酶添加量不大于0.08%時，隨著酶添加量的增加，肉糜水分活度沒有顯著性變化（p＞0.05），但當酶添加量達到0.10%時，肉糜的水分活度顯著降低（p＜0.05）。分析實驗原因，由于酶添加量較低，其嫩化程度較低，未起到提高肉糜保水性的作用，當酶添加量達到0.10%時，肉在木瓜蛋白酶的作用下降解程度較大，木瓜蛋白酶將肌動球蛋白分解為肌動蛋白和肌球蛋白，肌動蛋白易溶于水，使肉糜的保水性增強，從而使肉糜的水分活度顯著降低。

2.3 肉糜pH的變化

圖1 不同添加量的酶對pH的影響Fig.1 Effect of different enzyme content on pH

由圖1可見，與對照組相比，添加酶后，pH顯著降低（p＜0.05），且隨著酶添加量的增加，pH保持降低趨勢，即酶添加量對肉糜pH具有顯著影響（p＜0.05）。理論上，由于木瓜蛋白酶作用于肉中肌原纖維蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白等，蛋白質降解時會有羧基和氨基產生，而羧基會電離產生H+，使pH下降，由此設想，隨著降解反應的進行，pH不斷下降。譚光軒[8]在探究木瓜蛋白酶水解蛋白質pH變化與可溶性蛋白關系的實驗中發現，在酶解大豆蛋白時，隨著酶添加量升高（1%～7.5%），豆漿濃度下降（7%～1%），起始pH降低（9%～6.3%），且pH下降速度加快，可溶性蛋白含量增加，水解產物增加。崔春等[9]研究不同酶解時間對pH的影響，其實驗發現一般肽鍵的打開會導致pH下降，在相同初始pH條件下，隨著酶解時間的延長，反應前后體系pH降低的幅度逐漸增加。

2.4 肉糜色差的變化

圖2 不同添加量的酶對肉糜色差的影響Fig.2 Effect of different enzyme content on color

由圖2可見，與對照組相比，腌制中添加酶后，對肉糜各色差值均有顯著影響（p＜0.05）。其中CIE L*在酶添加量為0.08%時達到最大值，相對對照組提高了10.56%；CIE a*，CIE b*均在酶添加量為0.04%時達到最大值，其中紅度值提高了23.58%，黃度值提高了65.34%。當酶添加量繼續增加時，各色差值呈波動性變化，但變化不顯著。Rubén Garrido[10]發現，經過腌制后，紅度值和黃度值都增加。

分析原因可能是，酶作用后，體系pH下降，使得肉糜表面變白，從而導致肉糜亮度值增加。根據Jay等[11]的報道，pH的下降可引起肉表面產生褪色漂白的效果，這是由于保護亞鐵血紅素的球蛋白在低pH下變性導致的。肉糜中添加的糖結合生成一些復雜的分子，導致肉糜紅度值增加。肉中食鹽及脂肪的作用可能導致黃度值增加，Soyer[12]研究表明，如脂肪含量、斬拌、滾揉、凍藏等工藝條件對CIE b*有較大影響。在酶添加量為一定范圍內，當酶添加量繼續增加時，由于酶的作用達到一個相對極限的程度，使得色差值變得相對穩定，沒有顯著性變化。

2.5 肉糜TPA質構的變化

圖3 不同添加量的酶對肉糜硬度、膠性、咀嚼性的影響Fig.3 Effect of different enzyme content on hardness，gumminess and chewiness

由圖3可見，腌制過程中添加木瓜蛋白酶使得肉糜的硬度、膠性顯著下降（p＜0.01），分別下降了59.06%、37.63%，但當酶添加量大于0.02%時，肉糜硬度沒有顯著性變化（p＞0.05）；當酶添加量小于等于0.04%時，肉糜的咀嚼性沒有顯著性變化，當酶添加量大于0.04%時，肉糜咀嚼性相對對照組顯著下降（p＜0.05）。

分析原因是由于木瓜蛋白酶對肉產生作用，其作用組織主要是肌動球蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白，木瓜蛋白酶能將肌動球蛋白分解為肌球蛋白和肌動蛋白[13-15]。膠原蛋白和彈性蛋白是結締組織的主要成分，木瓜蛋白酶對這兩種蛋白質的作用能使結締組織降解成無定形的小塊，導致肉的嫩化[16]。Chunghee K Kang和Eldone Rice研究了菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、胰酶應用于肉中的嫩化效果，結果發現木瓜蛋白酶對水溶性、鹽溶性和不溶性肌肉組織片段都有較好的水解效果[17]。肌原纖維斷裂，肌纖維結構完整性的破壞，導致肉的硬度下降，使肉變得更加細膩和柔和。明建等[18]利用TAXT2i物性測定儀，研究了蛋白酶嫩化處理對牛肉及其制品物性的影響，結果表明，蛋白酶處理顯著降低了牛肉的烹飪失水率、剪切力、咀嚼性、彈性、回復性、黏聚性等物性指標，處理后牛肉的口感較好，沒有口感粗糙、韌性大而咀嚼費力的特征。楊艷等[19]利用木瓜蛋白酶對牛肉干進行嫩化，得出結果，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，牛肉干的硬度、咀嚼度均有所降低，降低了牛肉干的韌性，使之更易咀嚼，而且提高牛肉干的口感。

圖4 不同添加量的酶對肉糜彈性、凝聚性的影響Fig.4 Effect of different enzyme content on springiness and cohesiveness

由圖4可以看出，木瓜蛋白酶對肉糜的彈性沒有顯著性變化（p＞0.05）；與對照組相比，添加酶的各組肉糜凝聚性顯著提高（p＜0.05），但各組沒有顯著性差異，即酶添加量對凝聚性沒有顯著影響。肉糜凝聚性提高可能是由于酶對肉蛋白進行降解，蛋白分子量下降，且產生小分子肽、氨基酸，這些物質更易于促進凝聚、交聯，提高持水性和乳化活性。熊善柏等[20]報道，蛋白質經蛋白酶適度水解，保持和改進營養價值，降解生成小分子能夠改善其溶解性、乳化性、起泡性、持水性等功能特性。

由圖5可以看出，添加木瓜蛋白酶后，肉糜的黏著性顯著提高（p＜0.01），但在不同酶添加量的肉糜的黏著性中，添加量為0.08%較0.02%顯著提高（p＜0.05），其他各添加量的肉糜的黏著性沒有顯著性差異（p＞0.05）。這可能是由于木瓜蛋白酶作用于肌動球蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白等的程度不同，導致所形成的小分子的不同，從而使黏著性在表觀上呈現不同。肉蛋白經酶作用后，肌原纖維斷裂，在食鹽和食糖的作用下，肉糜變得柔軟，黏著性提高。楊艷等[19]利用不同含量的木瓜蛋白酶對牛肉干進行嫩化，得到了同樣的結果，其分析結果為木瓜蛋白酶可以使牛肉干中的結締組織以及肌纖維中結構較復雜的膠原蛋白、彈性蛋白進行適當降解，在一定程度上破壞了它們的結構。

圖5 不同添加量的酶對肉糜黏著性的影響Fig.5 Effect of different enzyme content on adhesiveness

2.6 相關性分析

由表4可知，CIE L*、CIE a*、CIE b*各色差值之間呈現顯著相關性（p＜0.05），其中CIE a*、CIE b*之間呈現極顯著相關性（p＜0.01）；各色差值和硬度、黏著性、凝聚性、膠性、咀嚼性之間均呈現顯著相關性（p＜0.05），其中CIE L*和膠性、咀嚼性呈現極顯著負相關性（p＜0.01），CIE b*和膠性、咀嚼性、硬度均呈現極顯著負相關性（p＜0.01）；表明肉糜的色澤和肉糜TPA質構各項指標之間具有良好的相關性。這種外在的相關性只是說明蛋白酶對豬肉糜作用使肉的色澤和肉的質構特性均發生變化，且二者呈現相反的變化趨勢，但對于肉的色澤與質構二者之間本身并不具備實際意義上的關聯性。

表4 各指標之間的相關性分析Table 4 The relationship analysis between the index

關于TPA質構的各項指標中，咀嚼性和凝聚性之間呈現顯著負相關性（p＜0.05），除彈性其他各項指標之間存在極顯著相關性（p＜0.01）；表明肉糜的質構各項指標具有很好的相關性，這從各項指標的定義也能看出來。Di Monaco等對15種食品的感官質地研究也表明硬度與易嚼性呈顯著正相關[21]。

除水分活度外，氨氮和CIE a*之間呈現顯著相關性（p＜0.05），和其他各指標之間均呈現極顯著相關性（p＜0.01）；表明酶對蛋白的降解作用以及對肌纖維的斷裂作用等都是同時進行，它們之間具備良好的相關性。除彈性、水分活度外，pH與其他指標也均呈現良好的相關性（p＜0.05），pH影響的是肉糜的內環境，當內環境發生微小變化，會以各項表觀指標表現出來，包括質構、色差等。

3 結論

3.1 腌制過程中添加木瓜蛋白酶，肉糜中的水溶性總氮和氨氮含量顯著提高（p＜0.05），其中總氮含量提高1.2倍，氨氮含量提高5倍。

3.2 由于酶解作用，使得肉蛋白中肽鍵斷裂，生成氨基酸等物質，從而使pH呈顯著下降趨勢（p＜0.05）。

3.3 肉糜加酶腌制后硬度、膠性呈極顯著下降趨勢（p＜0.01）；當酶添加量較小時，肉糜的咀嚼性沒有顯著性變化，當酶添加量大于0.04%時，肉糜咀嚼性相對對照組顯著下降（p＜0.05）；凝聚性、黏著性呈顯著升高趨勢（p＜0.05）；彈性沒有顯著性變化（p＞0.05）。

3.4 腌制中添加酶后，對肉糜各色差值均有顯著影響（p＜0.05）。其中CIE L*相對對照組提高了10.56%，CIE a*提高了23.58%，CIE b*提高了65.34%。

3.5 由相關性分析可知，色差值、TPA質構、氨氮、pH它們各自之間均具有良好的相關性，結果表明添加木瓜蛋白酶腌制對肉糜進行嫩化以及肉蛋白的降解和其內發生的各種理化變化具有一定的相關性。

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