五味子醇甲對APP/PS1雙轉基因癡呆模型小鼠腦組織突觸素、α-突觸核蛋白表達的影響

周妍妍，劉艷麗，董春雪，閆景東

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

老年性癡呆，又稱阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)，是發生在老年期及老年前期的一種原發性退行性腦病［1］，在發達國家，AD已成為繼心臟病、癌癥以及中風之后導致人類死亡的第4位原因。該病目前沒有理想的治療藥物，給社會和家庭帶來巨大的壓力。中醫傳統理論認為五味子具有安神定志、益智強識之功效，經常應用到防治癡呆的中醫經典方劑中(如地黃飲子、開心散、還少丹等)。五味子醇甲是五味子的重要有效成分，具有安定、鎮靜、抗驚活性，對大腦皮層的興奮抑制過程具有調節作用［2－3］，但對其防治 AD 的作用及機制研究較少。本研究選取APP/PS1雙轉基因癡呆模型小鼠為研究對象，觀察五味子醇甲對小鼠腦組織神經元變性、脫失及突觸功能等的影響，為其防治AD提供依據。

1 材料

1.1 藥品、試劑與儀器 SYP、α-syn免疫組化試劑盒:北京博奧森生物技術有限公司。五味子醇甲:成都曼斯特生物科技有限公司。鹽酸多奈哌齊片:衛材(中國)藥業有限公司，國藥準字:H20070181。病理圖像分析系統:cimas Med 6.0，麥克奧迪圖像技術有限公司。

1.2 實驗動物 ♂SPF級APP/PS1雙轉基因癡呆模型小鼠24只(編號:J004462，品系名稱:B6C3-Tg［APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/J］，南京大學模式動物研究所提供。同背景、同月齡的陰性小鼠8只。

2 方法

2.1 分組及給藥方法 APP/PS1雙轉基因癡呆模型小鼠隨機平均分為3組:轉基因小鼠組、鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組，每組8只;陰性小鼠8只為野生型小鼠組。鹽酸多奈哌齊組給予鹽酸多奈哌齊片(0.66 mg·kg－1·d－1)灌胃，五味子醇甲組給予五味子醇甲(10 mg·kg－1·d－1)灌胃，轉基因小鼠組給予等量生理鹽水灌胃，共4周。

2.2 取材方法 灌胃結束后進行行為學測試，測試后斷頭處死，腦組織置于4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片。

2.3 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，常規蘇木精－伊紅(HE)染色，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.4 尼氏染色 石蠟切片脫蠟至水，1%甲苯胺藍染色，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.5 免疫組織化學 切片脫蠟至水;修復抗原;PBS沖洗;滴加一抗工作液(1∶300)，4℃過夜;PBS沖洗2 min×3次;滴加二抗工作液，室溫20 min;PBS沖洗2 min×3次;DAB顯色;蘇木精復染;梯度酒精脫水，二甲苯透明、樹脂封片，顯微鏡下觀察。應用病理圖像分析系統對切片進行分析，200倍下每張切片隨機選取5個視野取平均值，將陽性目標總面積與統計場總面積的比值(面密度)作為統計數據。

3 結果

3.1 HE染色結果 野生型小鼠組可見神經細胞分布均勻，形態正常，層次清楚，核仁清晰;轉基因小鼠組可見神經細胞排列紊亂、疏松，細胞數量明顯減少，神經細胞萎縮，多見核深染、固縮現象;鹽酸多奈哌齊組病理表現較轉基因小鼠組有明顯改善，僅見少量神經細胞萎縮。五味子醇甲組可見膠質細胞增多，部分神經元萎縮，但較轉基因小鼠組明顯改善(Fig 1)。

Fig 1 Observation of mice brain tissues by HE staining

3.2 尼氏染色 野生型小鼠組神經細胞質中可見大量著深藍色呈斑塊狀尼氏小體;轉基因小鼠組細胞內尼氏小體大量脫失，胞質內僅散在少量尼氏小體。鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組尼氏小體脫失較轉基因小鼠組明顯減少(Fig 2)。

Fig 2 Observation of mice brain tissues by nissl staining

3.3 免疫組化

3.3.1 各組小鼠腦組織中SYP的表達 轉基因小鼠組腦組織SYP表達較野生型小鼠組明顯減少(P＜0.01)，鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組較轉基因小鼠組明顯增加(P＜0.01)，差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組之間差異無顯著性(Fig 3，Tab 1)。

Fig 3 Expression of SYP in mice brain tissues examined by immunohistochemical method

3.3.2 各組小鼠腦組織中 α-syn的表達 轉基因小鼠組腦組織α-syn表達較野生型小鼠組明顯增加(P＜0.01)，鹽酸多奈哌齊組和五味子醇甲組較轉基因小鼠組明顯減少(P＜0.01)，鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組之間差異無顯著性(Fig 4，Tab 1)。

Fig 4 Expression of α-syn in mice brain tissues examined by immunohistochemical method

4 討論

APP/PS1雙轉基因癡呆模型小鼠腦組織出現神經細胞數量減少，神經元萎縮，膠質細胞增多、尼氏小體脫失等病理變化，五味子醇甲可明顯改善其腦組織的病理改變，顯示了其神經保護作用。SYP位于突觸囊泡上，與突觸結構和功能關系密切，其表達的水平可有效地反映突觸的狀態［4］。AD患者腦內的神經淀粉樣變性可導致突觸變性，SYP的含量降低，突觸后反應減弱，最終導致突觸傳遞障礙，從而引起記憶和認知功能下降，導致AD發生。在AD發病早期，突觸數量減少比神經元喪失更顯著，還伴有突觸病理性變化［5］。所以，SYP是AD治療的標志之一。本研究結果顯示，轉基因小鼠組腦組織中SYP明顯降低，五味子醇甲可提高SYP的表達。αsyn是中樞神經系統突觸前膜的小分子可溶性蛋白質，是AD患者腦內老年斑除Aβ以外的另一重要成分，但其在AD發病中的機制尚不完全清楚。目前認為可能是α-syn的增多和病理性聚集減弱了突觸前囊泡的釋放，干擾了神經元的軸漿轉運，導致突觸功能障礙。另外，有研究發現α-syn的病理性積聚可導致細胞的凋亡或死亡［6－7］。還有研究發現，APP轉基因擬癡呆小鼠模型腦內 α-syn明顯增加［8］，與本研究的結果相符合。本研究中APP/PS1雙轉基因癡呆模型小鼠腦組織中α-syn明顯增高，五味子醇甲治療后α-syn較模型組明顯降低，表明降低α-syn可能是五味子醇甲防治AD的重要途徑。

Tab 1 Effect of schisandrin on expression of SYP and α-syn in mice brain tissue(±s，n=8)

Tab 1 Effect of schisandrin on expression of SYP and α-syn in mice brain tissue(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs transgenic mice group

Group SYP α-syn Wild Type group Transgenic mice group Donepezil hydrochloride group Schisandrin group 0.230 ±0.030＊＊0.163 ±0.021 0.211 ±0.030＊＊0.198 ±0.024*0.063 ±0.076＊＊0.110 ±0.011 0.080 ±0.007＊＊0.084 ±0.013＊＊

綜上可見，五味子醇甲可通過減輕APP/PS1雙轉基因癡呆模型小鼠神經元變性、脫失，改善突觸功能等途徑起到防治AD的作用。

［1］吳彥霖，辛曉潔，辛現良，耿美玉.GXXXG結構對老年性癡呆相關蛋白功能調節研究進展［J］.中國藥理學通報，2011，27(1):1－4.

［1］Wu Y L，Xin X J，Xin X L，Geng M Y.Research progress about the regulation of GXXXG structures in the Alzheimer-related protein［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(1):1－4.

［2］李海濤，胡 剛.五味子醇甲抑制6-羥基多巴胺誘導PC12細胞凋亡的研究［J］.南京中醫藥大學學報，2004，20(2):96－7.

［2］Li H T，Hu G.Study on the protective effects of schizandrin on 6-OHDA-induced apoptosis of cultured PC12 Cells［J］.J Nanjing Univ Tradit Chin Med，2004，20(2):96－7.

［3］王 蕾，唐 勇，黃 山.五味子乙素和五味子醇甲對PC12細胞氧化損傷的保護作用［J］.中國臨床康復，2006，47(10):64－7.

［3］Wang L，Tang Y，Huang S.Protective effects of schisandrin B and schisandrin on oxidative damage in PC12 Cells［J］.Chin J Clin Rehabilitat，2006，10(47):64－ 7.

［4］Khvotchev M V，Sudhof T C.Stimulus dependent dynamic homo and hetero multimerization of synaptobrevin/VAMP and synaptophysin［J］.Biochemist，2004，43(47):15037－ 43.

［5］Jacobsen J S，Wu C C，Redwine J M，et al.Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mouse model of Alzheimer's disease［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(13):5161－6.

［6］Dev K K，Hofele K，Barbieri S，et al.PartⅡ:alpha-synuclein and its molecular pathophysiological role in neurodegenerative disease［J］.Neuropharmacol，2003，45(1):14－44.

［7］徐 杰，張國華，陶恩祥.利福平抑制 α-synuclein的聚集及對MPP+誘導細胞損傷的拮抗作用［J］.中國病理生理雜志，2006，22(10):2032－5.

［7］Xu J，Zhang G H，Tao E X.Rifampicin inhibits the expression and aggregation of α-synuclein and antagonizes MPP ～ +-induced PC12 cells damage［J］.Chin J Pathophysiol，2006，22(10):2032－5.

［8］Dewachter I，Van Dorpe J，Smeijers L，et al.Aging increased amyloid peptide and caused amyloid plaques in brain of old APP/V717I transgenic mice by a different mechanism than mutant presenilin1［J］.J Neurosci，2000，20(17):6452－8.