藍莓花色苷提取工藝的優化研究

張學寧, 高志華, 劉慶忠, 李會平, 師莉莎

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018；2. 河北經貿大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050061；3.山東省果樹研究所，山東泰安 271000)

藍莓花色苷提取工藝的優化研究

張學寧1, 高志華2, 劉慶忠3, 李會平2, 師莉莎1

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018；2. 河北經貿大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050061；3.山東省果樹研究所，山東泰安 271000)

以體積分數為0.1%的鹽酸乙醇溶液為提取液，探討藍莓果實花色苷的最佳提取工藝。采用單因素和正交設計來考察乙醇體積分數(A)、料液比(B)、溫度(C)、時間(D)、火力(E)在水浴法、微波法和超聲波法3種提取方法中的作用。通過光譜掃描確定了藍莓花色苷的最大吸收峰在535 nm處，水浴法、超聲波法和微波法提取藍莓果實花色苷的最佳工藝分別為A3B3C2D3，A3B2C1D3和A2B2C2E3。品種間花色苷的最適宜提取方法亦有所不同：超聲波法最優，適于北陸和喬治2個品種；微波法次之，適于伯克利品種；水浴法提取效果最差。

藍莓；花色苷；提取工藝

藍莓又名藍果越桔、藍漿果，為杜鵑花科越桔屬植物。藍莓果實呈藍色，果肉細膩，果味酸甜，風味獨特，其花色苷等多酚類物質是所有水果與蔬菜中含量最高的[1]。藍莓果實中的花色苷是品質優良的天然色素，具有很強的抗氧化性，具有消除自由基、降低血清膽固醇、抗腫瘤、促進視網膜上視紅素再合成等生理活性功能[2-3]，可廣泛用于食品和醫藥領域。

花色苷一詞是 MARGUART 在1835年首先用來命名矢車菊花朵中的藍色提取物時提出來的，現在為同類物質的總稱。花色苷不穩定，在植物中主要以花色苷糖配體存在。目前普遍采用的提取方法主要有水浴法[4]、醇提法[5-6]、樹脂法[7]、微波法[8-9]、超聲波法[10]等。藍莓果中花色苷存在于細胞內或吸附在由纖維素組成的細胞壁上。常規的浸提法提取效率低，成本高，且存在溶劑殘留。正交設計試驗和響應面法已在食品工業有廣泛的應用[11-14]。與響應面法相比，正交設計試驗是一種高效率、快速、經濟的設計方法。為了更有效地開發藍莓花色苷資源，筆者采用無毒的乙醇溶劑提取輔助水浴法、超聲波法和微波法，以有助于細胞的破碎以及花色苷的釋放[10]，采用單因素和正交設計試驗相結合對藍莓果實中的花色苷提取工藝進行優化，以期探索最佳提取工藝，提高花色苷的提取率，篩選出最佳的提取工藝參數。

1 材料與方法

1.1材料

將伯克利(Berkeley)、北陸(Northland)、喬治(Georgiagem)等3個藍莓品種的果實(均采自山東省果樹研究所)采摘后立即冷凍并于-40 ℃保存。實驗開始后，將果實放入恒溫電熱鼓風干燥箱內，于45 ℃下恒溫烘干果實至恒重，粉碎后過380 μm (40目)篩子。將過篩的果粉放入干燥器中避光、干燥保存。

1.2花色苷最大吸收峰的確定

精確稱取0.5 g藍莓果粉，用鹽酸乙醇浸提，真空抽濾，定容至25 mL。取10 mL提取液，用pH值為1.0的溶劑(25 mL 0.2 mol/L KCl+75 mL 0.2 mol/L HCl)定容至25 mL，進行光譜掃描，確定最大吸收峰。

1.3提取溶劑的選擇

精確稱取0.5 g藍莓果粉，在40 ℃、料液比為1 g∶20 mL(簡稱1∶20,下同) 條件下，分別用表1中提取劑浸提120 min，抽濾并用相應的浸提液定容至25 mL。分別取定容好的浸提液10 mL，用pH值為1.0的溶劑定容至25 mL，采用pH值示差法[15]測定花色苷吸光度值，篩選出合適的提取劑。

表1 花色苷提取劑

注：表1中百分數表示體積分數，下同。

1.4提取方法

取藍莓果粉每份0.2 g，以乙醇+鹽酸溶液為提取劑，試驗前預處理24 h。設計乙醇濃度(體積分數，下同)、提取時間、提取溫度、料液比及微波火力的單因素試驗，見表2。浸提后抽濾并定容至25 mL，取10 mL提取液，用pH值為1.0的溶劑定容至25 mL。

表2 藍莓花色苷提取單因素試驗設計

2 結果與討論

2.1花色苷最大吸收峰的確定

花色苷在中性和弱堿性溶液中不太穩定，提取時通常采用酸性提取劑，在較低的pH值(<4)時花色苷的4種主要結構之間存在平衡，有明顯的吸收峰出現[5，16]。孟憲軍等研究認為，當pH 值分別為1和3時，溶液吸光度值變化不明顯, 顏色為深紅色[17]。本試驗將在酸性(pH值為1.0)提取液中浸提的花色苷在400～900 nm波長范圍內進行光譜掃描，結果見圖1。

圖1 花色苷吸收峰光譜掃描圖Fig.1 Scan spectrum of blueberry extracts

由圖1可以看出，花色苷最大吸收峰在535 nm處。該結果與LOHACHOOMPOL等報道的藍莓果實花色苷的最大吸收峰在538 nm處基本一致[18]，但與王秀菊等用藍莓釀酒果渣中提取的花色苷的最大吸收峰在520 nm處有一定差異[5]。這可能與實驗所選用藍莓的花色苷的性質有關。

2.2提取劑的選擇

石碧等研究認為藍莓花色苷是水溶性多酚類物質，可溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑中[19]。水中加入一定量的乙醇形成多酚復合體系，更適宜多酚的提取。在相同提取條件下，通過pH值示差法測定藍莓花色苷吸光度。不同提取劑的提取結果見圖2。

圖2 不同提取劑的提取結果Fig.2 Test results of anthocyanins extracted with different solvents

如圖2所示，用表1中1，2，3號提取劑與用4，5，6號提取劑相比花色苷吸光度差異比較顯著，后三者間差異不顯著?？紤]到甲醇有毒，而乙醇具有溶解性能好、對植物細胞穿透能力強等優點，本實驗選擇了5號溶劑(80%乙醇+0.1%鹽酸)作為最佳提取劑。

2.3水浴法

2.3.1 單因素實驗結果

水浴法單因素實驗結果見圖3。

圖3 水浴法單因素分析Fig.3 Extraction of anthocyanin treated with water-bath affected by different factors

花色苷提取率隨乙醇體積分數的增加而升高，如圖3 a)所示，其體積分數為60%～90%時花色苷吸光度都比較高。從節約乙醇的角度考慮，乙醇適宜體積分數為60%～80%。

料液比的增加能提高分子擴散速率、縮短平衡時間，因而使溶解在提取劑中的花色苷增多，從而增加了提取量。從圖3 b)可以看出，吸光度值在料液比為1∶15時最大；料液比為(1∶15)～(1∶25)時提取率變化較小。從提高效果、減少溶劑量和降低濃縮負荷等方面考慮，料液比為(1∶15)～(1∶20)較為合適。

升溫能提高花色苷的溶解度和擴散速度，而且有助于細胞的破壞、提高細胞膜的通透性。由于花色苷對熱敏感，研究人員認為當溫度超過某一臨界溫度時會加速花色苷的氧化和降解，反而使提取率下降[20-23]。從圖3 c)可以看出：當溫度小于50 ℃時，花色苷吸光度值隨時間的增加逐漸升高，在50 ℃時花色苷吸光度達最大值，溫度再高吸光度值開始下降，可能是由于溫度高了出現了降解現象。因此，水浴溫度為40～60 ℃較好。

提取時間越長，提取也越充分。但張華等研究認為花色苷易發生氧化、降解損失，時間越長雜質越多[24]。從圖3 d)可以看出，花色苷吸光度值隨時間的延長而逐漸升高，在水浴時間為120 min時花色苷吸光度達到最高，時間再長吸光度值下降，這可能是出現了降解現象。綜合測定結果及時間效益，超聲時間為90～150 min較好。

2.3.2 正交試驗結果

根據單因素分析的結果進行正交設計，如表3所示，各種因素對提取效果影響的主次順序為乙醇體積分數>時間>溫度>料液比。根據正交試驗結果分析得知，最佳提取條件應為A3B3C2D3，即使用0.1%的鹽酸乙醇溶液，在乙醇體積分數為80%、料液比為1∶20、溫度為60 ℃條件下，對藍莓果粉水浴120 min進行花色苷提取，測定提取的花色苷吸光度值為0.257。該組合低于試驗編號8和編號9的值，方差分析得出與試驗編號8和編號9差異不顯著，并且各因素影響順序為A>C>D>B，所以選用A3B3C2D3合理。本試驗的結果與王秀菊等的主要差異在于降低了水浴溫度，從而減少了花色苷的降解，同時提取時間延長，使提取效果更充分[5]。

表3 水浴法提取藍莓花色苷正交試驗結果

2.4超聲波輔助提取法

2.4.1 單因素實驗結果

同水浴的單因素分析原理，根據圖4超聲波法的單因素處理結果，花色苷提取選取體積分數為50%～70%的乙醇，料液比為1︰10，1︰15，1︰20，超聲時間為20，30，40 min，提取溫度為40～60 ℃進行正交設計。

單因素實驗結果見圖4。

圖4 超聲波輔助提取法單因素分析Fig.4 Extraction of anthocyanin treated with ultrasonic affected by different factors

2.4.2 正交試驗結果(見表4)

表4 超聲波輔助提取法提取藍莓花色苷正交試驗結果

從表4可以看出，各種因素對提取效果影響的主次順序為料液比>溫度>乙醇體積分數>超聲時間。根據以上實驗結果分析，最佳提取條件為A3B2C1D3，即使用體積分數為0.1%的鹽酸乙醇溶液，乙醇體積分數為70%，料液比為1∶15，溫度為60 ℃，超聲波頻率為40 kHz，對藍莓粉末超聲20 min進行花色苷提取，測定提取的花色苷吸光度值為0.222。該組合低于實驗編號3和編號9。由方差分析得出編號3和編號9差異不顯著，并且各因素影響順序為B>D>A>C，所以選用A3B2C1D3最佳的提取工藝。

2.5微波提取法

2.5.1 單因素實驗結果(見圖5)

同水浴的單因素分析原理，圖5 a)和圖5 b)中花色苷提取選乙醇體積分數為60%～80%，料液比為1∶10，1∶15，1∶20進行正交試驗。

圖5 微波提取法單因素分析Fig.5 Extraction of anthocyanin treated with microwave affected by different factors

花色苷吸光度與時間關系如圖5 c)所示。提取時間為10 s時花色苷吸光度值最大，提取時間大于10 s后吸光度逐漸降低。微波作用時間越長，吸光度越高，但微波時間長同時也會導致升溫過快，從而使提取液中的乙醇揮發，所以時間越短越好。故提取時間選取5，10，15 s進行正交試驗。

花色苷吸光度與火力的關系如圖5 d)所示。由于微波對細胞膜具有破碎作用，花色苷吸光度值隨著火力的增大逐漸增加，火力增大到80 kHz時吸光度值達到最大，之后開始減小，所以選擇火力控制在60～100 kHz進行正交試驗。

2.5.2 正交試驗結果(見表5)

從表5可以看出，各種因素對提取效果影響的主次順序為料液比>微波時間>乙醇體積分數>火力。最佳提取條件為A2B2C2E3，即使用體積分數為0.1%的鹽酸乙醇溶液，在乙醇體積分數為70%、料液比為1∶15、火力為100 kHz條件下，對藍莓粉末微波10 s進行花色苷提取。試驗驗證該條件下，測定提取的花色苷吸光度值為0.277，方差分析結果顯示應該選取A2B2C2E3為最優組合。

表5 微波法提取藍莓花色苷正交試驗結果

2.6其他藍莓品種花色苷的提取(見表6)

表6 不同藍莓品種的花色苷吸光度值

應用以上3種方法篩選出的最佳工藝條件提取3個藍莓品種的花色苷。由表6可以看出，對于伯克利品種而言，水浴法和超聲波法差異不顯著，微波法差異顯著且更適于該品種。對于北陸和喬治2個品種，3種提取方法都有顯著差異，而超聲波法更適于這2個品種花色苷的提取。目前，關于藍莓花色苷的提取方法，提取溶解輔助水浴法的研究較多，但是超聲波法和微波法用于藍莓花色苷的提取報道較少。本實驗結果顯示這2種提取方法明顯優于水浴法，且以超聲波法最佳。

/

[1] 李穎暢,宣景宏,孟憲軍. 藍莓果中花色素苷的研究進展[J].食品研究與開發,2007, 28(1):178-180.

LI Yingchang, XUAN Jinghong,MENG Xianjun.Research progress of blueberry anthocyanins[J].Food Research and Development,2007, 28(1):178-180.

[2] 李亞東,張志東,吳 林. 藍莓果實的成分及其保健功能[J].中國食物與營養, 2002(1): 27-28.

LI Yadong,ZHANG Zhidong,WU Lin. Blueberry fruit ingredients and its health care function[J]. Food and Nutrition in China, 2002(1): 27-28.

[3] 胡雅馨,李 京,惠伯棣. 藍莓果實中主要營養及花青素成分的研究[J].食品科學, 2006, 27(10): 600-603.

HU Yaxin,LI Jing,HUI Boli. Blueberry fruit study on major nutrition and anthocyanins[J]. Food Science , 2006, 27(10): 600-603.

[4] 馬慧萍,賈正平,謝景文,等. 淫羊藿總黃酮的提取分離工藝研究[J].華西藥學雜志, 2002,17(1):1-3.

MA Huiping,JIA Zhengping,XIE Jingwen,et al. Studies on extraction and separation of total flavonoid of herbaepimedii[J]. West China Journal of Pharmaceutical Sciences ,2002,17(1):1-3.

[5] 王秀菊,杜金華,馬 磊,等. 藍莓酒渣中花色苷提取工藝的優化及其穩定性的研究[J].食品與發酵工業,2009(9): 109-121.

WANG Xiuju,DU Jinhua,MA Lei,et al. Anthocyanin from blueberry wine pomace:Extraction optimization and stability test[J]. Food and Fermentation Industries, 2009(9): 109-121.

[6] MATAIX E, de CASTRO M D. Determination of anthocyanins in wine based on flow-injection, liquid-solid extraction, continuous evaporation and high-performance liquid chromatography-photometric detection[J]. Journal of Chromatography A, 2001, 910: 255-263.

[7] NORBAK R, BRAANDT K, NIELSEN J K, et al. Flower pigment composition of cross species and cultivars used for a chemotaxonomic investigation[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2002, 30: 763-791.

[8] 周 謹,閏小燕,賀高紅,等. 微波提取銀杏黃酮苷的方法研究[J].天然產物研究與開發, 2002, 14(1): 42-45.

ZHOU Jin,RUN Xiaoyan,HE Gaohong,et al. Study on extraction of ginkgo biloba flavonoid glycosides by microwave treatment[J].Natural Product Research and Development, 2002, 14(1): 42-45.

[9] 趙麗娟,王翠艷,陳崇軍. 葛根總黃酮的兩種不同提取方法比較[J]. 鞍山鋼鐵學院學報, 2002,25(2): 105-107.

ZHAO Lijuan,WANG Cuiyan,CHEN Chongjun. Comparation of two different methods for extraction of total anthoxanthinfrom pueraria thomsonii benth[J].Journal of Anshan Institute of I.& S. Technology, 2002,25(2): 105-107.

[10] 王錚敏. 超聲波在植物有效成分提取中的應用[J]. 三明高等專科學校學報, 2002, 19(4): 45-53.

WANG Zhengmin. Applications of ultrasonic extraction in effective constitution of plants[J].Journal of Sanming College, 2002, 19(4): 45-53.

[11] 王曉林，鐘方麗，孫 威，等.東北鐵線蓮總多酚的超聲提取工藝研究[J].河北科技大學學報，2012，33(1)：32-35.

WANG Xiaolin,ZHONG Fangli,SUN Wei, et al.Study on extraction technology of total polyphenols inClemmatisManshuricaRupr. [J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2012，33(1)：32-35.

[12] 仇 燕，仇彥博. 柚皮總黃酮超聲波輔助提取工藝的研究[J].河北科技大學學報,2010,31(4):330-333.

QIU Yan,QIU Yanbo. Ultrasonication-assisted extraction of total flavonoids from fruit peels of guanxipomelo[J].Journal of Hebei University of Science and Technology, 2010,31(4):330-333.

[13] 馮海燕，李向軍，胡瑞省.超聲法提取萹蓄總黃酮的正交試驗研究[J].河北科技大學學報,2011,32(6):611-614.

FENG Haiyan,LI Xiangjun,HU Ruisheng. Orthogonal test in extraction of total flavonoids from polygonum aviculare by ultrasonic method [J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2011,32(6):611-614.

[14] 王 健，張雪霞，王淑華,等.美伐他汀提取工藝研究[J].河北工業科技,2010,27(1):35-37.

WANG Jian,ZHANG Xuexia,WANG Shuhua,et al. Study on process of mevastat in extraction[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology,2010,27(1):35-37.

[15] 霍琳琳,蘇 平,呂英華.分光光度法測定桑葚總花色苷含量的研究[J]. 釀酒，2005, 32(4): 88-89.

HUO Linlin,SU Ping,LYU Yinghua.Measurement of total anthocyanins in mulberry by UV- visible spectroscopy[J].Liquor Making,2005, 32(4): 88-89.

[16] 闞建全. 食品化學[M ]. 北京: 中國農業大學出版社, 2002.

KAN Jianquan. Food Chemistry[M].Beijing: China Agricultural University Press,2002.

[17] 孟憲軍,于 娜,李穎暢, 等. 藍莓花色素苷穩定性研究[J]. 食品研究與開發, 2008,29(4):49-53.

MENG Xianjun,YU Na,LI Yingchang,et al.Study on the stability of anthocyanins from blueberry[J]. Food Research and Development,2008,29(4):49-53.

[18] LOHACHOOMPOL V, SRZEDNICKI G, CRASKE J. The change of total anthocyanins in blueberries and their antioxidant effect after drying and freezing[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2004, 5: 248-252.

[19] 石 碧, 狄 瑩. 植物多酚[M]. 北京: 科學出版社, 2000.

SHI Bi,DI Ying. Plant Polyphenols[M].Beijing:The Science Press,2000.

[20] 陸國權,吳小蓉．黑豆皮色素的提取及其理化性質研究[J]．中國糧油學，1997，12(3)：55-57.

LU Guoquan,WU Xiaorong.Pigment extraction from dark soybean skin and its physical and chemical properties[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 1997，12(3)：55-57.

[21] 雙長明，陳學平．楊梅果汁花色苷及其色澤穩定性的研究[J]．食品與發酵工業，1991(3)：1-6.

SHUANG Changming,CHEN Xueping. Myrica rubra fruit anthocyanins and color stability[J].Food & Fermentation Industry ,1991(3)：1-6.

[22] 鄭 杰，丁晨旭，趙先恩，等.花色苷化學研究進展[J].天然產物研究與開發，2011，23(5)：970-978.

ZHENG Jie,DING Chenxu,ZHAO Xianen,et al.Review of anthocyanins chemical studies[J].Natural Product Research and Development,2011,23(5):970-978.

[23] 位佳靜，鄧浩紅，田小燕，等.花色苷穩定化途徑及自聚合效應研究進展[J].包裝與食品機械，2012，30(4)：44-49.

WEI Jiajing,DENG Haohong,TIAN Xiaoyan,et al.Advance in research of anthocyanins stabilization approach and self-association effect[J].Packaging and Food Machinery,2012,30(4):44-49.

[24] 張 華,李景琳,李傳新, 等．越桔紅色素提取工藝的研究[J]．遼寧農業科學，1998, 29(2)：8-12.

ZHANG Hua,LI Jinglin,LI Chuanxin,et al. Study on the extraction technology of red pigment from blueberry[J]. Liaoning Agricultural Science，1998, 29(2)：8-12.

Optimization of extraction procedure of anthocyanins from blueberry

ZHANG Xuening1, GAO Zhihua2, LIU Qingzhong3, LI Huiping2, SHI Lisha1

(1.School of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang Hebei 050018, China; 2.School of Biological Science and Engineering, Hebei University of Economics and Business, Shijiazhuang Hebei 050061, China; 3.Shandong Institute of Pomology, Tai'an Shandong 271000, China)

The optimum procedure for anthocyanins extraction from blueberry with 0.1% HCl ethanol as solvent was discussed. Orthogonal design and single factor method were used to determine the effects of the concentration of alcohol (A), the material (B), the tradition time(C), the tradition temperature (D) as well as the wave energy (E) in water-bath method, micro-wave method and ultrasonic method. It shows that the maximum absorption wavelength of the pigment is 535 nm. The optimal conditions for water-bath, ultrasonic, and microwave extraction areA3B3C2D3,A3B2C1D3andA2B2C2E3, respectively. The above three combinations were applied to the anthocyanins extraction of three cultivars named Berkeley, Georgiagem and Northland. It shows that the ultrasonic method is better than the other two, the microwave extraction is second better, while water-bath is the last.

blueberry; anthocyanin; extraction procedure

1008-1534(2013)02-0066-07

TS264

A

10.7535/hbgykj.2013yx0115

2012-10-08;

2012-11-20

責任編輯：張士瑩

河北科技大學青年基金資助項目(XL200764)；河北科技大學博士科研啟動基金資助項目(QD200964)；河北科技大學大學生科技及創新項目

張學寧(1976-)，女，河北辛集人，講師，博士，主要從事細胞工程及其生物活性物質方面的研究。

E-mail:xueningzhang@sohu.com