大蹼鈴蟾的線粒體基因組D-loop區序列分析

張 雁 韓毛振 羅學才 王晶晶

（1 合肥師范學院生命科學系，安徽 合肥 230061）

（2 安徽大學生命科學學院，安徽 合肥 230601）

大蹼鈴蟾（Bombina Maxima）隸屬無尾目（A-nura）、盤舌蟾科、鈴蟾屬，外形似蟾蜍，頭寬略大于頭長；吻鈍圓，吻棱不顯；無鼓膜，無顳褶，舌近圓形，周圍與口腔粘膜相連；犁骨齒二短列，橫置內鼻孔內側后方。四肢粗壯，趾間全蹼或近全蹼，皮膚極粗糙，整個背面滿布大瘰粒，瘰粒之間及其上面滿布小刺，體側及四肢刺疣多。成體體長60 mm左右。鈴蟾屬分布于歐洲到東亞一帶，是我國最原始的無尾目，有毒，腹部顏色鮮艷，遇到危險時露出腹部的警戒色。在我國盤舌蟾科只有鈴蟾屬中的東方鈴蟾（BombinaBombina）、強刺鈴蟾（Bombinafortinuptialis）、微蹼鈴蟾（Bombinamicrodeladigitora）、大蹼鈴蟾（Bombina Maxima）四種鈴蟾分布。大蹼鈴蟾（Bombina Maxima）棲于海拔2500–3600m中高山環境中，國內分布于四川、云南及貴州等地，在東南亞靠近云南的地區也有分布。

線粒體是細胞進行氧化磷酸化提供能量的場所[1]，是真核細胞內的重要的細胞器。脊椎動物線粒體DNA是一個環形雙鏈結構，少數也有線性的，長度約為 15-22kb[2，3]；線粒體 DNA 從硬骨魚類到哺乳動物具有相對保守性[4]，由于其具有分子量小，結構簡單，呈母系遺傳，進化速率快等特點，已被廣泛應用于動物遺傳學、分類學、疾病機理研究[5，6]及類群間的系統發生關系的研究。關于線粒體基因組的研究較多的集中在對于其蛋白編碼基因和rRNA基因的研究。對于線粒體基因組中的非編碼區（D-loop區）研究較少。近年來發現其非編碼區（D-loop區）包含重鏈的復制起始位點和3個保守區[7-9]，并發現在部分物種的非編碼區（D-loop區）中存在串聯重復序列。

本文采用LA-PCR、測序技術和生物信息學的方法，研究了大蹼鈴蟾的線粒體基因組的非編碼區域。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

PCR儀、超速冷凍離心機、凝膠成像系統、電泳儀、恒溫水浴鍋、移液槍、制冰機，超凈工作臺、恒溫培養箱、滅菌鍋、電子天平、純水儀等。

1.2 樣品來源和基因組DNA提取

成體大蹼鈴蟾（1♂），2004年采自云南玉龍雪山，標本現-80℃保存。總DNA采用Sambrook的方法[10]從肌肉組織中提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 引物設計和PCR擴增

綜合參考黑斑蛙（Rananigromaculata）、東方鈴蟾（Bombinaorientalis）的線粒體基因組全序列，先用CLUSTAL W1.8[11,12]比對同源區段，在D-loop區兩端的保守區段設計1對兼并引物，通過LA-PCR技術擴增目的序列。

圖1 大蹼鈴蟾線粒體基因組D-loop區LA-PCR結果

LA-PCR反應循環參數為：

94℃預變性 1min，97℃變性 10s，58℃退火15min，30個循環，最后72℃延伸10min。

取5μl PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外觀察PCR產物擴增情況，凝膠成像系統掃描記錄結果。目的片段經純化試劑盒 （V-gene DNA凝膠回收試劑盒）純化后，克隆到E.colipGEM-T載體中，篩選陽性克隆進行培養，菌液委托上海英駿生物技術有限公司測序（ABI 3730 DNA測序儀）。序列分析采用 BioEdit、DNASTAR（2001）軟件和測序峰圖結果分析進行拼接，去除兩端多余序列最后得到大蹼鈴蟾的D-loop區完整基因序列。

2 結果與分析

2.1 大蹼鈴蟾線粒體基因組D-loop區序列擴增結果

大蹼鈴蟾線粒體包括D-loop區在內的基因序列擴增長度約為3500 bp（圖1）。

2.2 大蹼鈴蟾線粒體基因組D-loop結構分析

通過對大蹼鈴蟾線粒體基因組D-loop區的測序和分析，去除兩端多余序列，得出大蹼鈴蟾的mtDNA中的D-loop區全長2987bp，其中包括三個保守序列（CSB-1,CSB-2 and CSB-3）[13]，其結構比較類似[14]。目前已知部分始蛙亞目在3`端有串聯重復序列。大蹼鈴蟾D-loop區的5`端和3`端各有明顯的串聯重復序列VNTR （a）和VNTR（b），因此造成其D-loop區長度較一般始蛙亞目物種較長。而除明顯的串聯重復序列（a）（b）外，大蹼鈴蟾的mtDNA的D-loop區VNTR（a）之后還有序列（5`-TAA-3`）重復 4 次，緊接著VNTR（b）有一個（5`-TGGTGGGGG-3`）的序列重復兩次，在這個重復序列之后就是tRNAPhe（圖2）。

圖2 大蹼鈴蟾D-loop區主要結構特征

在大蹼鈴蟾D-loop區5`端有一段總長989bp的重復序列（a），共重復了13次，將這13次重復的序列比對后發現這些重復序列大部分極其相似，但也有細微差別（圖3）。第一次重復的序列5`端有所差異，第13次重復的序列3`端缺少了一段，中間的重復序列第9次重復多了一段20bp的序列，其他的重復序列極其保守。

D-loop 3`端有一段總長556bp的重復序列（b），為66bp左右的序列重復了9次，其中2、3段重復序列在順序上只有只有第38個堿基的差別，一個是堿基 C，一個是堿基 A；4、5、6、7、8 段的重復序列完全相同；其第1次重復的5`端有差異；第9次重復串聯重復序列的3`端的序列也是缺少了一段（圖4）。

圖4 大蹼鈴蟾D-loop區的3`端串聯重復序列（b）

3 討論

大蹼鈴蟾的mtDNA的D-loop區全長2437bp，具有三個保守序列 （CSB-1，CSB-2 and CSB-3）。其5`端和3`端各有明顯的串聯重復序列。D-loop區因其調控整個mtDNA的復制和轉錄,又稱為控制區，是線粒體全序列中變化最大的區域。物種和個體之間長度的差異主要是由于串聯重復序列造成的。串聯重復序列多數位于中央控制區的兩側。這表明控制區易發生插入和缺失突變而其功能卻不受影響。線粒體基因組中重復序列的產生機制還沒有完全確定,一般認為是復制滑脫和非同源性重組的結果[15-17]。新蛙亞目有很多物種D-loop很長，尤其是在樹蛙科中：斑腿泛樹蛙（Polypedatesmegacephalus）2224bp，史立積綠樹蛙（Rhacophorusschlegelii）5659bp，卡吉卡蛙（Buergeriabuergeri）4575bp， 馬 達 加 斯 加 彩 蛙（Mantellamadagascariensis）6977bp。但是在始蛙亞目中，線粒體D-loop區一般在1000-2000bp左右，大蹼鈴蟾D-loop區與其他始蛙亞目相比較長，這可能是因為其5`端和3`端各有明顯的串聯重復序列，而大多數始蛙亞目只在3`端有明顯的串聯重復序列。

通過分析我們發現大蹼鈴蟾的這些串聯重復序列具有以下規律：

1.臨近的重復序列同源性較高，在（a）中，重復片斷（1 2 3）；（5 6 7）；（8 10 11 12）同源性很高，在重復序列（b）中（1 2 3）；（4 5 6 7 8）分別相似。

2.在整個串聯重復序列中的處于5`和3`端的第一次和最后一次的重復序列片斷中往往不完整，第1次的重復序列的5`端常發生改變，最后一次的重復序列的重復序列往往發生缺失。

3.重復序列有時會插入一些片斷。在VNTR（a）中的第9次重復序列的中間就插入了一段長19bp的序列。

4.重復片斷的差異是一種漸變的差異。

這些串聯重復序列表現出來的特征可能是復制滑脫和非同源性重組過程中產生的，對于分析線粒體基因組中重復序列的產生機制有十分重要的意義。

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