改良血管阻塞方法建立大鼠全腦缺血模型*

嚴(yán)智文 董河 馮偉 牛澤軍 褚海辰 隋愛華

缺血性腦損傷嚴(yán)重危害人類健康。在缺血性腦血管病基礎(chǔ)研究中，建立穩(wěn)定、可靠及操作簡(jiǎn)便的動(dòng)物模型是開展各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)。目前公認(rèn)的Pulsinelli[1]大鼠全腦缺血四血管模型是研究多種缺血性腦疾病經(jīng)典模型之一。由于該方法具有可較好地模擬臨床上因低血壓休克、心肺腦復(fù)蘇等造成的全腦缺血性損傷過(guò)程及易于大宗實(shí)驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)經(jīng)典的Pulsinelli四動(dòng)脈結(jié)扎法被許多學(xué)者所使用[2-3]。但此模型也存在制備復(fù)雜，成功率低，儀器設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)。參考此法，在保證模型質(zhì)量的前提下，通過(guò)反復(fù)實(shí)踐和摸索，積累了一些經(jīng)驗(yàn)。本文旨在設(shè)計(jì)一種新型簡(jiǎn)捷的制作方法，可顯著提高模型制作的成功率及縮短制作時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠68只（省動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：slxk20080002），體質(zhì)量250~300 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組8只，傳統(tǒng)模型組及改良模型組各30只。

1.2 模型制作方法

1.2.1 改良組 大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉（3 ml/kg）[4]，俯臥位固定于操作臺(tái)上，消毒后剪開頸后正中皮膚約2 cm，沿正中切口鈍性逐層分離組織直到暴露第1頸椎；后再沿第1頸椎斜向內(nèi)上尋找翼孔；翼孔完全顯露后，插入自制燒灼器燒灼翼孔5~6次，2~3 s/次，造成雙側(cè)椎動(dòng)脈永久閉塞[5]，后消毒縫合組織。再將大鼠仰臥位固定，消毒后切開頸前區(qū)皮膚2 cm，沿氣管兩側(cè)逐步分離暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈鞘，游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，后置線系活結(jié)，消毒縫合組織，自由飲食。24 h后將大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上，于清醒狀態(tài)下拆開頸部縫合線，提取線結(jié)，同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈；夾閉10 min后松開動(dòng)脈夾造成復(fù)灌，縫合組織自由飲食。

1.2.2 傳統(tǒng)組 大鼠充分顯露翼孔后，磨鉆仔細(xì)地沿翼孔表面逐層打磨骨面，直至完全顯露穿行其中的椎動(dòng)脈，后接雙極電凝器，在顯微鏡直視下用雙極電凝充分燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈，造成椎動(dòng)脈永久閉塞，其余步驟同改良組。

1.2.3 假手術(shù)組 大鼠充分暴露翼孔后不燒灼，大鼠游離頸總動(dòng)脈后不系線，其余步驟同改良組。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用白熾燈照射使大鼠肛溫保持在（37.0±0.5）℃及每批大鼠缺血及復(fù)灌都在同一時(shí)間。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 生理指征 雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉后1 min內(nèi)出現(xiàn)動(dòng)物意識(shí)喪失，眼球變白，雙側(cè)瞳孔對(duì)光反射消失，翻正反射消失，自主呼吸加快。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中凡不符合上述標(biāo)準(zhǔn)或大鼠出現(xiàn)抽搐及死亡視為失敗。

1.4.2 行為學(xué)檢測(cè) 模型建立7 d后用Morris水迷宮進(jìn)行大鼠空間定向能力檢測(cè)。Morris水迷宮是由圓形水池，自動(dòng)攝像機(jī)及電腦分析系統(tǒng)組成。測(cè)試前將水注入池內(nèi)，水深30 cm（即水面高出站臺(tái)1 cm，使大鼠看不見站臺(tái)），水溫控制在（25±1）℃。T組、I組各隨機(jī)選出造模成功的8只大鼠與S組大鼠用于測(cè)試。整個(gè)測(cè)試過(guò)程分為兩部分：第1階段為學(xué)習(xí)階段，第1天訓(xùn)練先將大鼠放在人工平臺(tái)上適應(yīng)1 min，然后讓大鼠自由游泳尋找平臺(tái)，120 s內(nèi)未找到平臺(tái)者，實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺(tái)。從第2天起，將大鼠從一個(gè)象限的固定位置面向池壁放入水中，讓其進(jìn)行定向航行尋找平臺(tái)。若在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者將大鼠引致平臺(tái)停留10 s，記錄尋臺(tái)時(shí)間，超過(guò)120 s按120 s計(jì)算。每天上下午固定時(shí)間各訓(xùn)練1次，將兩次尋臺(tái)時(shí)間的平均值作為當(dāng)日空間學(xué)習(xí)測(cè)試的成績(jī)，共持續(xù)4 d。第2階段為測(cè)試階段，即在第5天同一時(shí)間撤去平臺(tái)，固定位置面向池壁放入大鼠，記錄大鼠第1次跨越平臺(tái)的時(shí)間即潛伏期，超過(guò)120 s按120 s計(jì)算。

1.4.3 HE染色 各組大鼠于再灌后相應(yīng)時(shí)間取大鼠麻醉后，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液透心灌注，斷頭后取腦于視交叉后冠狀面1~4 mm之間腦組織，后固定2 h，洗滌4 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。在海馬平面冠狀切片，切片厚5 μm，室溫保存。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用（±s）表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠制模成功率、制模時(shí)間及儀器費(fèi)用 在充分預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)組大鼠I組大鼠造模成功25只，成功率83%（25/30）；T組大鼠造模成功20只，成功率67%（20/30）；從翼孔完全暴露開始計(jì)時(shí)，到燒灼椎動(dòng)脈結(jié)束為止，I組平均燒灼時(shí)間約為31 s，T組平均燒灼時(shí)間約為612 s，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。T組儀器顯微鏡75萬(wàn)，磨鉆15萬(wàn)，電凝器10萬(wàn)；I組電烙鐵系市場(chǎng)普通電烙鐵，約15元。

2.2 行為學(xué)及病理組織學(xué)指標(biāo)判定

2.2.1 Morris水迷宮測(cè)試 與S組相比，模型組大鼠學(xué)習(xí)階段尋臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，而其記憶測(cè)試潛伏期也明顯長(zhǎng)于S組，I組與T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2.2 HE染色 海馬組織病理學(xué)改變，S組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核圓而規(guī)則，核膜清楚，有明顯的核仁，核膜境界清楚。模型組大量錐體細(xì)胞核不規(guī)則并固縮深染，胞漿嗜伊紅，細(xì)胞間隙明顯增大，胞漿呈空泡樣變，正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（圖1）。

表1 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果比較（±s） s

表1 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果比較（±s） s

*與S組相比，P<0.01；△與前1天時(shí)間點(diǎn)相比，P<0.01

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天S組 （n=8）106.63±7.7881.38±6.2841.63±6.1925.13±6.0018.63±3.60 T組 （n=8）112.13±6.4590.75±7.42*57.38±6.30*△36.63±6.32*△28.13±5.06*△I組 （n=8）112.75±6.3289.75±6.63*57.13±7.00*△38.13±5.94*△25.75±5.44*△

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)（HE，×200）

3 討論

全腦缺血損傷在臨床實(shí)踐中常見，因此全腦缺血再灌注模型的建立是缺血性腦損傷實(shí)驗(yàn)研究的一個(gè)重要方法。它比體外或局灶模型能夠更好地模擬臨床中出現(xiàn)的低血壓及心臟驟停等缺血模式，也更符合麻醉手術(shù)中的臨床實(shí)際。Pulisinelli等[1]在1979年首先報(bào)告了大鼠前腦缺血模型的制備，可在動(dòng)物清醒狀態(tài)下且不改變?nèi)硌鲃?dòng)力學(xué)造成大腦缺血而被廣泛重視。1984年Told采用鉆透環(huán)椎翼小孔的方法，充分暴露椎動(dòng)脈后直視下燒杓椎動(dòng)脈，其成功率幾乎達(dá)100%[6]。

在實(shí)際模型建立過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雖然參考了Pulsinelli的經(jīng)典方法，但利用該方法制作模型仍存在一些缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)在：（1）為閉塞雙側(cè)椎動(dòng)脈，需要對(duì)大鼠第1頸椎內(nèi)后方的翼孔進(jìn)行研磨以暴露其中穿行的椎動(dòng)脈進(jìn)行燒灼；由于翼孔存在變異（有些大鼠開口較小或存在兩個(gè)開口），直接燒灼往往不能完全閉塞椎動(dòng)脈；且翼孔壁薄研磨，鉆透翼小孔極易傷及椎動(dòng)脈造成大出血而導(dǎo)致模型制作失敗。（2）椎動(dòng)脈阻斷方法中，電凝法需要手術(shù)顯微鏡和單極電凝，電流不易控制，過(guò)低不能燒灼椎動(dòng)脈，過(guò)高則會(huì)可損傷腦干，對(duì)動(dòng)物損傷大，還可能電傷操作者[7]；熱凝固法中需要不斷用酒精燈對(duì)針進(jìn)行加熱，如果燒灼動(dòng)作太慢，熱能散失，反而燒針會(huì)粘破椎動(dòng)脈，引起動(dòng)物大量失血死亡。（3）經(jīng)典的Pulsinelli 4 d后分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，易造成大鼠缺血缺水死亡。針對(duì)上述缺點(diǎn)，我們對(duì)傳統(tǒng)的4-VO制作大鼠全腦缺血模型的方法進(jìn)行了改進(jìn)。首先，采用自制燒灼器直接插入翼孔反復(fù)燒灼，無(wú)需研磨骨面，儀器制作簡(jiǎn)單且損傷小。其次，自制燒灼器可持續(xù)加熱，熱量恒定，避免了熱能散失而粘破椎動(dòng)脈。再次，在動(dòng)物存活24 h后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，從而避免了主觀因素的影響，縮短模型制作的周期。

實(shí)驗(yàn)證明，大腦區(qū)海馬組織對(duì)缺血性損傷十分敏感，尤其是CA1區(qū)神經(jīng)元，因此，在全腦缺血模型中，CA1區(qū)神經(jīng)元成為相對(duì)獨(dú)立于其他腦區(qū)的理想的實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全腦缺血再灌注后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退。兩側(cè)海馬組織CA1區(qū)出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元核固縮和神經(jīng)細(xì)胞丟失。這些行為學(xué)和組織病理學(xué)的變化證明我們采用的全腦缺血/再灌注損傷大鼠模型的復(fù)制是成功的。傳統(tǒng)組及改良組大鼠均成功復(fù)制全腦缺血再灌注模型。相比之下，改良組手術(shù)方法成功率高，縮短制模時(shí)間，方法簡(jiǎn)便可靠，無(wú)需特殊儀器，值得推廣。

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