牙周組織發育期上皮剩余的組織學觀察

于西佼 唐開亮 杜毅

上皮剩余是成熟牙周膜中唯一的上皮結構，上皮剩余的在牙周組織修復再生、內環境穩定等方面的可能作用已得更多研究人員的重視[1]，但目前對上皮剩余的研究仍比較匱乏，本文觀察牙周組織發育期的上皮剩余細胞形態分布，研究該期上皮剩余細胞的增殖、凋亡及OPN和BSP的表達。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 原位細胞凋亡試劑盒（Roche German）；OPN和BSP多克隆抗體由Larry W.Fisher博士（National Institute of Dental and Craniofacial Research，Maryland，USA）饋贈；PCNA和Bcl-2單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑（北京中杉）；Tris/HCI（Sigma USA），蛋白酶K（MERK German）；OLYMPUS顯微鏡及照相系統（JAPAN）。

1.2 標本制備 取出生后第15、19和25天的BALB/c小鼠12只（山東大學動物實驗中心），引頸處死，解剖分離含下頜第一磨牙區下頜骨，新鮮配置4%多聚甲醛固定、10%EDTA脫鈣2個月，近遠中向5 μm連續切片。HE染色觀察牙周組織的發育和上皮剩余的分布和細胞形態。

1.3 免疫組化 采用SP免疫組化法對PCNA、Bcl-2、OPN和BSP表達進行免疫組織定位。常規石蠟切片水化至水，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗，正常山羊血清室溫孵育20 min，傾去血清，滴加的PCNA、Bcl-2、OPN和BSP抗體（均1:100稀釋），37 ℃溫箱孵育2 h。PBS沖洗，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，孵育15 min后滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，滴加DAB液鏡下顯色，蘇木素復染3 min，常規脫水、透明封片。

1.4 細胞凋亡檢測采用原位末端標記（TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL）法，石蠟切片常規脫蠟水化至水，按照細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書操作，常規脫水封片，鏡下觀察照相。以PBS液代替TUNEL反應液作陰性對照。凋亡細胞陽性表達位于細胞核，為覆蓋整個細胞核的棕黃色或褐色著色。

2 結果

2.1 HE染色 上皮剩余細胞靠近牙骨質表面呈簇狀分布，主要分布于牙頸部和根分叉，簇內細胞數量不等，排列無規則，相互重疊，部分細胞界限不清，胞核不規則呈較強的嗜蘇木精染色（圖1）。

2.2 TUNEL檢測細胞凋亡 小鼠出生后第19天，牙槽骨形成活躍，可見較多新生成骨細胞，牙周膜主纖維斜形埋入頜骨內。TUNEL結果顯示，牙周膜中可見較均勻分布的凋亡陽性表達的成纖維細胞（圖2）部分成骨細胞呈凋亡陽性表達，可見觀察到凋亡小體存在。牙根根分叉處的牙周膜牙骨質側可見較多的ERM，部分呈TUNEL陽性表達（圖3）。

2.3 免疫組化 牙周膜牙骨質側的上皮剩余細胞呈PCNA陰性或弱陽性表達（圖4），大量成纖維細胞呈PCNA陽性表達；上皮剩余細胞呈Bcl-2陰性表達，牙周膜牙槽骨側Bcl-2陽性表達強于牙周膜牙骨質側（圖5）。OPN的免疫組化結果示，牙骨質與牙周膜界面可見較強的棕黃著色，上皮剩余細胞呈陽性表達（圖6）。未見ERM細胞陽性表達BSP。

圖1 上皮剩余呈團塊狀，與周圍成纖維細胞分界較明顯。（HE×20）(AL牙槽骨,D牙本質,OB成骨細胞,PDL牙周膜)

圖2 調亡陽性表達細胞（箭頭）和細胞凋亡小體（*示）（TUNEL×40）

圖3 上皮剩余細胞呈凋亡陽性表達（TUNEL×40）

圖4 上皮剩余細胞呈PCNA陰性表達，牙周膜中散在陽性表達的細胞（SP×40）

圖5 上皮剩余呈Bcl-2陰性表達。牙周膜牙槽骨側Bcl-2陽性表達強于牙周膜牙骨質側（SP×20）

圖6 上皮剩余細胞陽性表達OPN（SP×20）

3 討論

上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath）的誘導功能結束后，發生斷裂，部分上皮細胞離開根面，遷入牙周膜，形成上皮剩余。牙周發育期牙槽骨改建活躍、牙周膜主纖維走向調整，上皮根鞘斷裂后最終形成上皮剩余，所以上皮根鞘斷裂后所經歷的更新或塑形形成上皮剩余也是牙周組織正常發育的一部分。本研究結果表明，牙周組織發育過程中，上皮剩余細胞與牙周組織中的成骨細胞和成纖維細胞一樣都可觀察到細胞凋亡。成熟的牙周組織中的上皮剩余細胞在受到炎癥等信號刺激后呈現增殖活性，可參與牙源性囊腫的發生[2]。牙周組織發育期上皮剩余細胞可發生細胞凋亡，但我們研究結果未發現此時上皮剩余細胞出現明顯的增殖活性，提示其可能缺乏相關刺激因素，從而為表現明顯增殖活性。有研究證實，伴隨牙齒萌出，建合期在咬合力作用下上皮剩余表現出明顯增殖的活性[3]。

細胞培養證實上皮剩余細胞可分泌前列腺素（prostaglandins）和骨吸收因子（bone resorbing factor），從而認為上皮剩余可能有抑制骨性結合，維持牙周膜間隙的作用[4]。Hasegawa等[5]發現在牙骨質修復中，上皮剩余細胞表現PCNA活性，其可能參與牙骨質的修復。OPN和BSP都是骨礦化相關因子，在骨質的形成和礦化中發揮重要作用，這些骨礦化相關蛋白可能在牙骨質的形成中發揮一定作用，有研究已證實OPN在牙骨質的形成發揮重要作用[6]。本研究結果證實，牙周發育期的上皮剩余細胞也表達OPN，與他們的實驗結果相一致。上皮剩余并不是完全無用的剩余結構，在某些特定時期或刺激因素下可表現出積極的生物學性狀，從而發揮某些生物學功能，不過其機制有待深入研究。

[1] Haku K，Muramatsu T，Hara A，et al.Epithelial cell rests of Malassez modulate cell proliferation，differentiation and apoptosis via gap junctional communication under mechanical stretching in vitro[J].Bull Tokyo Dent Coll，2011，52（4）：173-182.

[2] Talic N F，Evans C A，Daniel J C，et al.Proliferation of epithelial rests of Malassez during experimental tooth movement[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop，2003，123（5）：527-533.

[3] 于西佼.上皮根鞘和上皮剩余在牙齒發育過程中的生物學性狀和作用研究[D].山東大學，2007.

[4] Rincon J C，Xiao Y，Young W G，et al.Production of osteopontin by cultured porcine epithelial cell rests of Malassez[J].J Periodontal Res，2005，40（5）：417-426.

[5] Hasegawa N，Kawaguchi H，Ogawa T，et al.Immunohistochemical characteristics of epithelial cell rests of Malassez during cementum repair[J].J Periodont Res，2003，38（1）：51-56.

[6] Yamamoto T，Domon T，Takahashi S，et al.Determination of two different types of cellular cementogenesis in rat molars:a histological and immunohistochemical study[J].Matrix Biol，2005，24（4）：295-305.