肉桂抑制人宮頸癌細胞生長增殖的體外研究*

余涌珠 何冬梅 李江濱 歐嘉文 鄭若洋 陳婉嫦 蔡夢珊 林錦瓊

肉桂是樟科植物，樹皮芳香，可做香料，肉桂的桂皮含有揮發(fā)油，油中主要成分為桂皮醛、少量乙酸桂皮酯，桂皮酸和肉桂醇D1、D2等。肉桂藥用價值最早載于《神農(nóng)本草藥》，有溫經(jīng)通脈，健脾燥胃，消腫利濕，發(fā)汗解肌之功能[1]，但關于其抗腫瘤研究少且不夠深入。宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第二位[2]，傳統(tǒng)的放化療治療方法副作用大，目前的研究表明中醫(yī)藥在腫瘤防治中前景廣闊，中藥治療癌癥有高效低毒的優(yōu)點。本次實驗通過體外實驗觀察肉桂對人宮頸癌Hela細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌Hela細胞株，由廣東醫(yī)學院衰老研究所提供。Synergy2多功能酶標儀（Biotek），F(xiàn)ACSCanto2流式細胞儀（美國BD公司），CO2培養(yǎng)箱（RSBiotech），OLYMPUS XD-101倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司），超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 用10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細胞，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 藥物配制 取0.5 g肉桂單味中藥顆粒（廣東一方制藥有限公司）加5 ml超純水，高壓滅菌制得濃度為100 mg/ml肉桂水煎液；氟尿嘧啶（5-FU，25 mg/ml，天津金耀氨基酸有限公司）注射液用除菌無血清培養(yǎng)基稀釋為2.5 mg/ml，備用。

1.4 方法

1.4.1 CCK-8法測定細胞生長抑制率

1.4.1.1 肉桂抑制腫瘤細胞增殖的量效作用 采用96孔板，設高中低3個劑量肉桂組、5-FU組、對照組，每組3個平行孔，每孔加入100μl細胞懸液（含5×103個細胞），待細胞貼壁完全后，加入5μl藥液，高中低3個劑量肉桂組終濃度分別為5.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.2 mg/ml的肉桂水煎液，5-FU組終濃度為0.1 mg/ml的5-FU，對照組加等體積培養(yǎng)液。5% CO2，37 ℃孵育48 h后，按照CCK-8試劑盒說明書操作，酶標儀測吸光值。

1.4.1.2 肉桂抑制腫瘤細胞增殖的時效作用 采用96孔板，設對照組和肉桂組，每組3個平行孔，每孔加入100 μl細胞懸液（含5×103個細胞），待細胞貼壁完全后，加入5 μl藥液，肉桂組終濃度為5.0 mg/ml肉桂水煎液，對照組加等體積培養(yǎng)液。5% CO2，37 ℃孵育分別12、24、48、72 h后，按照CCK-8試劑盒說明書操作，酶標儀測吸光值。

1.4.2 貼壁率實驗 采用48孔板，設對照組和肉桂組（終濃度為5.0 mg/ml肉桂水煎液），每組3個平行孔，每孔加入200 μl細胞懸液（含1×104個細胞），孵育4 h貼壁后，吸去培養(yǎng)液用 PBS洗2遍后，每孔加入200 μl 培養(yǎng)液和20 μl的CCK-8混合液，37 ℃ 5% CO2孵育1 h后，用酶標儀測每孔的吸光值。

1.4.3 對細胞遷移能力的影響 采用劃痕實驗，實驗分組同上，按參考文獻[3]進行。

1.4.4 FCM測細胞周期 實驗分組同上，采用PI染色法，將PI染色的單細胞懸浮液用流式細胞儀測試10 000個細胞，進行細胞計量術分析，用Wincycle 32軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。計數(shù)資料采取字2檢驗，實驗圖像采用Image pro plus 6.0分析處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法測定細胞生長抑制率 肉桂對腫瘤有明顯抑制作用且隨著藥物濃度的增加而增強。作用48 h后，0.2、1.0、5.0 mg/ml肉桂水煎液的抑制率分別為15.40%、24.58%、97.12%，5-FU組為68.41%。5.0 mg/ml肉桂水煎液作用12 h的細胞增殖抑制率為57.46%，24 h為88.52%，48 h為95.32%，72 h為95.81%。

2.2 貼壁率結果 Hela細胞對照組的貼壁率為100%，肉桂組的貼壁率為48.3%（P<0.05）。

2.3 對細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗結果見表1。與對照組相比，肉桂組的Hela細胞劃痕間隙恢復緩慢，說明腫瘤細胞遷移能力顯著下降（P<0.05）。

表1 對Hela細胞劃痕間隙的影響（±s） μm

表1 對Hela細胞劃痕間隙的影響（±s） μm

*與對照組比較，P<0.05

組別0 h12 h24 h36 h48 h對照組472.14±28.75363.30±23.17229.57±25.81120.33±17.0060.18±11.18肉桂組478.04±30.19*456.88±23.12*415.49±19.6*391.73±22.22*364.50±20.6*

2.4 FCM檢測細胞周期 對照組相比，肉桂組G1期比例略降低，S期比例明顯降低，G2期明顯增多。表明肉桂使宮頸癌細胞主要阻滯在G2期，見表2。

表2 腫瘤細胞周期變化 %

3 討論

肉桂含有多種有效成分，以往實驗已證實肉桂中的桂皮醛對人多種腫瘤細胞具有殺傷作用，肉桂酸對人肺腺癌細胞有誘導分化作用，鄰羥基肉桂酸鍺對小鼠宮頸癌有抑制作用，肉桂提取物可通過調節(jié)CD8+T細胞抑制腫瘤的生長[4-6]。

本實驗結果表明肉桂能顯著抑制宮頸癌細胞增殖，且該抑制作用具有量效和時效作用，并能顯著抑制宮頸癌細胞的貼壁，降低細胞遷移能力。細胞周期結果顯示肉桂組S期比例明顯降低，G2期明顯增多，說明肉桂可能通過抑制染色體復制，將宮頸癌細胞阻滯在G2期。

[1] 韋如萍，黃永芳，胡德活，等.肉桂的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].經(jīng)濟林研究，2006，24（3）：65-70.

[2] Andrawiss M.Cervical cancer vaccines available in 2005[J].Drug Discov Today，2005，10（14）：949-950.

[3] 黃敏麗，羅國客，陳維平，等.Tumstatin肽對條件培養(yǎng)基下視網(wǎng)膜脈絡血管內(nèi)皮細胞遷移的影響[J].實驗研究，2008，26（6）：448-450.

[4] 梁秋霞.肉桂有效成分提取及其生物活性研究[D].廣西大學，2010.

[5] 葉連寶，歐小敏，涂潔瓊，等.鄰羥基肉桂酸鍺對小鼠U14宮頸癌的抑制作用[J].西北藥學雜志，2010，25（6）：438-439.

[6] Kwon H K，Jeon W K，Hwang J S，et a1.Cinnamon extract suppresses tumor progression by modulating angiogenesis and the effector function of CD8+T cells[J].Cancer Letters，2009，278（2）：174-182.